目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一。过去5-10年中由于饮食结构的改变、老龄化及环境污染等因素,我国结直肠癌的发病率和死亡率迅速上升。对于早期结直肠癌患者手术切除是首选的治疗方案。但在我国约20-25%的结直肠癌患者被诊断时即为IV期出现了转移,另有25%左右的患者在治疗期间出现转移,失去根治性手术治疗的机会,该类型的患者如果不给予任何治疗,其平均生存期仅为6-9个月。除外科手术外,药物治疗在结直肠癌的生长和转移抑制中具有重要的地位。目前化疗联合西妥昔单抗或者贝伐珠单抗在一定程度上能够阻止结直肠癌的进展,但由于肿瘤细胞耐药性的出现及药物本身的毒副作用,导致长期效果差,结直肠癌的术后复发率和死亡率仍较高。因此,寻找一种新的、安全有效的药物显得尤为重要。百里酚(Thymol)是一种天然酚类化合物,在食品、医疗和化妆品领域被认为是安全无毒的。既往研究表明,百里酚在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中具有明显的抑制作用,但其作用机制尚不明确。而且,百里酚对结直肠癌是否具有抑制作用、潜在作用机制如何,目前研究甚少。方法:首先利用甲醇对百里香全株进行提取,然后经柱层析及半制备型HPLC纯化后获得活性成分百里酚。利用CCK-8检测百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖抑制及对FHC的细胞毒性作用;平板克隆形成实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测百里酚对HCT116和Lovo细胞周期分布和凋亡的影响;Transwell迁移和侵袭实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。利用针对β-catenin的过表达质粒和小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)将HCT116和Lovo细胞中的β-catenin基因分别进行过表达和沉默,进一步分析改变β-catenin的表达对百里酚CRC细胞增殖、迁移和侵袭抑制作用的影响。另外通过皮下注射和尾静脉注射HCT116细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型和结直肠癌转移模型,分析百里酚对裸鼠移植瘤生长和结直肠癌血行播散转移的抑制作用。进一步我们采用实时荧光定量PCR、免疫印迹以及免疫组化的方法,从m RNA水平和蛋白水平上检测百里酚对CRC细胞内、瘤体组织及肺转移组织中增殖、凋亡及转移相关基因表达的影响。结果:百里香中主要活性成分-百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖具有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈现出一定的时间和浓度依耐性。百里酚(0-120mg/ml)对正常结直肠粘膜FHC细胞无明显的细胞毒作用。与对照组相比较,百里酚各组中细胞克隆形成数明显降低,有显著统计学差异(P<0.001)。细胞周期实验结果显示,百里酚能够有效地将HCT116和Lovo细胞阻滞于G0/G1期。Hoechst33258染色和流式细胞技术分析结果显示百里酚能够诱导CRC细胞的凋亡。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示百里酚能够降低HCT116和Lovo细胞的迁移和侵袭能力,且具有剂量依耐性。百里酚能够通过激活Bax/Bcl-2信号通路诱导CRC细胞凋亡。此外,百里酚能够通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活,抑制CRC细胞上皮-间质转化(EMT)、侵袭和转移;β-catenin的过表达能够部分阻遏百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用,反之,β-catenin的沉默能够增加百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用。另外,在体内百里酚能够剂量依耐性的抑制裸鼠移植瘤的生长,同时抑制结直肠癌HCT116细胞的肺转移,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin通路的激活,从而抑制CRC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT有关。结论:本研究以百里酚为研究对象,采用多种研究方法证实了百里酚体内外对结直肠癌细胞生长和转移的抑制作用及机制。百里酚能有效的将HCT116和Lovo细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制增殖。百里酚能够通过下调CRC细胞内Bcl-2/Bax比值,诱导HCT116和Lovo细胞凋亡。百里酚能够降低HCT116和Lovo的迁移和侵袭能力,阻碍EMT进程。在体内百里酚能够抑制裸鼠移植瘤的生长及结直肠癌的肺转移。百里酚抑制CRC细胞的增殖、转移和EMT,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关,β-catenin介导了百里酚的抗结直肠癌作用。综上所述,百里酚能够显著抑制结直肠癌的细胞增殖、侵袭、转移和EMT,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路来实现的;百里酚有望能够作为单一药物或与其他抗癌药物联合用于CRC的治疗。