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目的:褪黑素(Melatonin,Mel)是由松果体分泌的一种吲哚类激素,近期研究发现褪黑素对自由基介导的心血管疾病具有保护作用,但机制尚未完全阐明。故本文旨在进一步探究褪黑素抗心肌细胞氧化应激损伤的机制,从而为心血管疾病相关的分子机制和潜在的治疗靶点提供新的思路。方法:1.探究褪黑素对H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的影响。用100μM褪黑素预处理24 h,再用100μM H2O2处理30 min诱导H9c2细胞氧化应激损伤。采用CCK-8试剂盒检测各组细胞活性,DCFH-DA探针检测ROS水平,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,Western blot检测Bax、Bcl-2的蛋白表达水平。2.探究褪黑素对H2O2诱导的H9c2细胞miR-206和Cx43表达的影响。Western blot检测Cx43蛋白表达水平,qRT-PCR检测miR-206基因表达水平。3.探究过表达miR-206对褪黑素保护作用以及Cx43蛋白表达的影响。转染30 nM miR-206 mimic 24 h构建miR-206过表达的H9c2细胞,分别检测各组miR-206和Cx43表达情况、细胞活性、ROS水平、线粒体膜电位以及Bcl-2和Bax的蛋白表达情况。4.探究敲低Cx43对褪黑素保护作用的影响。转染50 nM Cx43 siRNA 24 h构建敲低Cx43的H9c2细胞,检测各组Cx43蛋白表达、细胞活性、ROS水平、线粒体膜电位以及Bcl-2和Bax的蛋白表达情况。5.探究miR-206对Cx43的靶向调控关系。双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-206与Cx43的靶向关系。分别转染30 nM/100 nM miR-206mimic/inhibitor至H9c2细胞24 h,检测miR-206基因和Cx43蛋白表达情况。6.探究褪黑素受体对褪黑素调控miR-206/Cx43轴抗H9c2细胞氧化应激损伤的影响。在用褪黑素预处理的同时用10μM褪黑素受体抑制剂(Luzindole,Luz)处理H9c2细胞24 h,分别检测各组miR-206和Cx43表达情况、细胞活性、ROS水平、线粒体膜电位以及Bcl-2和Bax的蛋白表达情况。结果:1.褪黑素保护心肌细胞免受H2O2诱导的氧化应激损伤。褪黑素预处理使细胞活性明显增加(p<0.01),ROS水平(p<0.001)和线粒体膜电位(p<0.001)显著改善,Bcl-2的表达显著增加(p<0.01),但Bax的表达显著降低(p<0.05)。2.褪黑素逆转H2O2诱导的心肌细胞miR-206增加和Cx43减少。褪黑素预处理使miR-206的表达显著减少(p<0.01),Cx43蛋白表达显著增加(p<0.001)。3.褪黑素通过抑制miR-206抗H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤。与mimic NC组相比,转染miR-206 mimic使miR-206的表达显著增加(p<0.001)、Cx43的蛋白表达显著减少(p<0.01),细胞活性(p<0.001)、线粒体膜电位(p<0.01)和Bcl-2的表达(p<0.01)显著降低,ROS水平(p<0.001)和Bax的表达显著增加(p<0.01)。4.褪黑素通过上调Cx43抗H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤。与si-NC组相比,转染Cx43 siRNA使Cx43蛋白表达显著减少(p<0.001);细胞活性(p<0.001)、线粒体膜电位(p<0.01)以及Bcl-2的表达(p<0.001)显著降低,ROS水平(p<0.001)和Bax的表达显著增加(p<0.001)。5.MiR-206靶向调控Cx43。MiR-206 mimic显著抑制Cx43野生型萤火虫荧光素酶活性(p<0.01);转染miR-206 mimic使Cx43的表达显著降低(p<0.001),然而转染miR-206 inhibitor使Cx43的表达显著增加(p<0.001)。6.褪黑素抗H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤依赖于褪黑素受体。褪黑素受体抑制剂(Luzindole)与褪黑素共处理使miR-206的表达(p<0.01)明显增加、Cx43的表达(p<0.01)明显降低,同时细胞活性(p<0.01)、线粒体膜电位(p<0.01)和Bcl-2的表达(p<0.01)明显降低,ROS水平(p<0.001)和Bax的表达(p<0.05)明显增加。结论:褪黑素通过miR-206/Cx43轴抗心肌细胞氧化应激损伤,而褪黑素受体介导了这一保护作用。