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稻米蒸煮食味品质(Eating and cooking quality，ECQ)是广受消费者、育种家、研究人员和农户关注的稻米品质性状。淀粉的理化特性是决定稻米ECQ的关键因素。直链淀粉含量(Amylose content，AC)和糊化温度(Gelatinization temperature，GT)较低、胶稠度(Gel consistency, GC)较软的稻米往往具有更高的ECQ。在淀粉合成相关基因(Starch synthesis-related genes，S SRGs)中，编码颗粒结合型淀粉合成酶Ⅰ(Granule-boundstarchsynthaseⅠ，GBSSⅠ)的蜡质基因(Waxy，Wx)是控制稻米AC和GC的主效基因、控制GT的微效基因，因此往往也被认为是决定稻米ECQ的首要基因。Wx基因座内的自然等位变异导致了现代水稻品种中AC和ECQ的广泛差异。优良Wx等位变异的应用，为稻米ECQ的改良育种带来了重大突破。近年来新型Wx自然等位变异的挖掘已进入了瓶颈，而现有Wx等位变异的缺陷逐渐引起了育种家和研究者的关注。为防止稻米品质的高度同质化以及满足不同地区消费者对稻米ECQ多样化的需求，当前育种家迫切需要可在现有广泛应用的Wx等位基因基础上进一步改良稻米品质的新型Wx等位基因。CRISPR/Cas技术的出现为创建新型Wx等位基因提供了可能。此外，编码可溶性淀粉合成酶Ⅱ(SolublestarchsynthaseⅡ，SSⅡ)的SSⅡ基因(包括SSⅡ-1、SSⅡ-2和SSⅡ-3)可以通过调节支链淀粉A链和B1链的比例调节稻米GT，也是影响稻米ECQ的关键基因。当前围绕SSⅡ基因的研究主要集中在SSⅡ-3(也叫ALK)基因，其被证明是控制GT的主效基因。而我们前期初步的研究结果显示，利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术下调SSⅡ基因中被忽略的SSⅡ-2基因的表达也可显著改良稻米ECQ，表明其在稻米ECQ形成中发挥了重要作用。
本研究基于此，一方面利用CRISPR/Cas9技术对Wx基因启动子关键位点和Wx基因编码区3端非催化结构域位点进行编辑，期望通过微调Wx基因表达或GBSSⅠ酶活的方式创建能适度调节稻米AC的新型Wx等位基因;另一方面在实验室前期积累的基础上，利用杂交和CIRSPR/Cas9技术对SSⅡ-2基因的功能及其在稻米品质形成中的作用进行解析，以期为稻米ECQ改良提供新的靶基因。主要研究结果如下:
1.通过Wx基因启动子顺式作用元件预测和GBSSⅠ蛋白结构域分析，本研究在Wx基因启动子上关键位点和Wx基因编码区3末端选取了9个靶位点(S1-S9)，在携带Wxb等位的常规粳稻日本晴背景下利用CRISPR/Cas9技术对其进行定点编辑。AAC测定结果显示，Wx基因核心启动子S7位点编辑材料的AAC显著降低，具有改良稻米品质的潜力。通过加代种植，共筛选到六种去除T-DNA插入的S7位点纯合突变类型，分别为Wxb-C/A、Wxb-A/C、Wxb-i1、Wxb-d2、Wxb-d8和Wxb-d15。海南冬季种植条件下，六种新型Wx等位变异的AC均显著降低，在常规粳稻(Wxb)和优质软米(Wxmp)之间呈梯度分布。稻米理化品质分析发现其稻米品质显著提高至接近优质软米水平，但籽粒外观仍保持高度透明，未出现类似于软米的暗胚乳缺陷。
2.Wx基因表达和启动子体外活性分析结果表明，编辑Wx基因启动子S7位点引起的AC变化主要是由Wx基因转录水平表达降低所致，编辑Wx基因核心启动子S7位点可有效调节Wx基因表达和直链淀粉合成。推测是由于编辑S7位点破坏了Wx基因核心启动子上某个或某些RNA聚合酶Ⅱ核心转录机制中通用型转录因子(General transcription factors，GTFs)的识别或结合位点，导致Wx基因基础水平转录降低所造成的。序列比对发现S7位点在Wxlv、Wxa、Wxin、Wxmp和Wxop等Wx自然等位变异中高度保守，表明在不同Wx自然等位变异中编辑S7位点将有机会获得更多AC变异的新型Wx等位基因，进一步丰富稻米品质改良的种质资源。
3.在扬州夏季和海南冬季两种种植条件下，含有S7位点编辑来源的六种新型Wx等位基因的水稻AC表现出不同的变化趋势和幅度:在海南冬季种植条件下，各材料的AC均显著降低;而在扬州夏季种植条件下，携带Wxb-C/A和Wxb-d15稻米的AC增加，携带Wxb-A/C、Wxb-i1、Wxb-d2和Wxb-d8稻米的AC小幅降低，其中仅有Wxb-d8的降幅达到了显著水平。通过灌浆结实期温度处理实验证实温度差异是导致两地AC变化差异的主要原因，表明编辑Wx基因启动子S7位点调节Wx基因表达响应温度。推测是由编辑S7位点降低了GTFs对Wx基因核心启动子识别或结合的热稳定性所致。深入探究GTFs识别或结合Wx基因核心启动子响应温度的机制，有望为选育兼顾优质和极端温度钝性的优质品种提供可能。
4.通过梯度烘干实验对在日本晴(Nip(Wxb))中创建的SSⅡ-2RNAi转基因材料及与其AC相近的软米对照在不同含水量情况下的籽粒外观进行比较。结果显示，SSⅡ-2RNAi转基因稻米在低含水量下仍保持良好的透明度，未出现类似于关东194、南粳9108和Nip(Wxmp)等软米对照的暗胚乳(半透明)缺陷。米粒横断面淀粉粒形态观察结果显示，在低含水量情况下，低AC和无AC的Nip(Wxmp)和Nip(wx)淀粉粒中间会产生空腔，且AC越低，空腔越多;而SSⅡ-2RNAi转基因材料和亲本Nip(Wxb)淀粉粒中没有空腔。推测这些空腔影响光在水稻籽粒中的穿透是导致籽粒透明度降低的主要原因。进一步的晶体特性分析显示，SSⅡ-2RNAi转基因材料淀粉的结晶度较亲本显著提升。推测下调SSⅡ-2基因的表达优化了SSⅡ-2RNAi转基因材料的淀粉晶体特性，导致其在低含水量情况下淀粉粒中间不形成空腔可能是其籽粒保持良好外观品质的主要原因。
5.通过杂交将SSⅡ-2RNAi结构导入日本晴背景、分别携带Wxa和wx等位基因的近等基因系Nip(Wxa)和Nip(wx)中。不同Wx等位基因背景中稻米理化品质和表达分析结果显示，抑制SSⅡ-2基因的表达在非糯背景中可协同调控直链淀粉和支链淀粉的合成进而改良稻米ECQ，在糯稻背景中仅能调控支链淀粉的合成优化稻米GT，表明Wx基因参与了SSⅡ-2RNAi转基因稻米的品质形成。本研究进一步通过CRISPR/Cas9技术创建了ssii-2、ssii-3单突变体和ssii-2ssii-3双突变体。分析结果显示，尽管ssii-2ssii-3突变体AC无显著降低，但其支链淀粉结构、GT和RVA谱均与SSⅡ-2RNAi转基因系高度相似，表明SSⅡ-3基因确实参与了SSⅡ-2RNAi转基因稻米的品质形成。因此，SSⅡ-2RNAi转基因稻米的ECQ显著提高是协同下调SSⅡ-2、SSⅡ-3和Wx三个基因的表达优化胚乳直链淀粉和支链淀粉合成的结果。
6.ssii-2突变体中稻米AC显著降低;在支链淀粉链长分布中，ssii-2突变体DP10-12和DP≥34链的比例较亲本对照略有增加，DP6-9和DP13-33链的比例略有减少，导致GT显著降低;SSⅡ-2突变后淀粉的晶体特性显著增加;SSⅡ-2突变后Wx基因和SSⅡ-3基因的表达均显著降低。这些结果表明SSⅡ-2在胚乳直链淀粉和支链淀粉合成中均发挥了重要作用，有望作为稻米ECQ和外观品质改良育种的新靶基因。
本研究基于此，一方面利用CRISPR/Cas9技术对Wx基因启动子关键位点和Wx基因编码区3端非催化结构域位点进行编辑，期望通过微调Wx基因表达或GBSSⅠ酶活的方式创建能适度调节稻米AC的新型Wx等位基因;另一方面在实验室前期积累的基础上，利用杂交和CIRSPR/Cas9技术对SSⅡ-2基因的功能及其在稻米品质形成中的作用进行解析，以期为稻米ECQ改良提供新的靶基因。主要研究结果如下:
1.通过Wx基因启动子顺式作用元件预测和GBSSⅠ蛋白结构域分析，本研究在Wx基因启动子上关键位点和Wx基因编码区3末端选取了9个靶位点(S1-S9)，在携带Wxb等位的常规粳稻日本晴背景下利用CRISPR/Cas9技术对其进行定点编辑。AAC测定结果显示，Wx基因核心启动子S7位点编辑材料的AAC显著降低，具有改良稻米品质的潜力。通过加代种植，共筛选到六种去除T-DNA插入的S7位点纯合突变类型，分别为Wxb-C/A、Wxb-A/C、Wxb-i1、Wxb-d2、Wxb-d8和Wxb-d15。海南冬季种植条件下，六种新型Wx等位变异的AC均显著降低，在常规粳稻(Wxb)和优质软米(Wxmp)之间呈梯度分布。稻米理化品质分析发现其稻米品质显著提高至接近优质软米水平，但籽粒外观仍保持高度透明，未出现类似于软米的暗胚乳缺陷。
2.Wx基因表达和启动子体外活性分析结果表明，编辑Wx基因启动子S7位点引起的AC变化主要是由Wx基因转录水平表达降低所致，编辑Wx基因核心启动子S7位点可有效调节Wx基因表达和直链淀粉合成。推测是由于编辑S7位点破坏了Wx基因核心启动子上某个或某些RNA聚合酶Ⅱ核心转录机制中通用型转录因子(General transcription factors，GTFs)的识别或结合位点，导致Wx基因基础水平转录降低所造成的。序列比对发现S7位点在Wxlv、Wxa、Wxin、Wxmp和Wxop等Wx自然等位变异中高度保守，表明在不同Wx自然等位变异中编辑S7位点将有机会获得更多AC变异的新型Wx等位基因，进一步丰富稻米品质改良的种质资源。
3.在扬州夏季和海南冬季两种种植条件下，含有S7位点编辑来源的六种新型Wx等位基因的水稻AC表现出不同的变化趋势和幅度:在海南冬季种植条件下，各材料的AC均显著降低;而在扬州夏季种植条件下，携带Wxb-C/A和Wxb-d15稻米的AC增加，携带Wxb-A/C、Wxb-i1、Wxb-d2和Wxb-d8稻米的AC小幅降低，其中仅有Wxb-d8的降幅达到了显著水平。通过灌浆结实期温度处理实验证实温度差异是导致两地AC变化差异的主要原因，表明编辑Wx基因启动子S7位点调节Wx基因表达响应温度。推测是由编辑S7位点降低了GTFs对Wx基因核心启动子识别或结合的热稳定性所致。深入探究GTFs识别或结合Wx基因核心启动子响应温度的机制，有望为选育兼顾优质和极端温度钝性的优质品种提供可能。
4.通过梯度烘干实验对在日本晴(Nip(Wxb))中创建的SSⅡ-2RNAi转基因材料及与其AC相近的软米对照在不同含水量情况下的籽粒外观进行比较。结果显示，SSⅡ-2RNAi转基因稻米在低含水量下仍保持良好的透明度，未出现类似于关东194、南粳9108和Nip(Wxmp)等软米对照的暗胚乳(半透明)缺陷。米粒横断面淀粉粒形态观察结果显示，在低含水量情况下，低AC和无AC的Nip(Wxmp)和Nip(wx)淀粉粒中间会产生空腔，且AC越低，空腔越多;而SSⅡ-2RNAi转基因材料和亲本Nip(Wxb)淀粉粒中没有空腔。推测这些空腔影响光在水稻籽粒中的穿透是导致籽粒透明度降低的主要原因。进一步的晶体特性分析显示，SSⅡ-2RNAi转基因材料淀粉的结晶度较亲本显著提升。推测下调SSⅡ-2基因的表达优化了SSⅡ-2RNAi转基因材料的淀粉晶体特性，导致其在低含水量情况下淀粉粒中间不形成空腔可能是其籽粒保持良好外观品质的主要原因。
5.通过杂交将SSⅡ-2RNAi结构导入日本晴背景、分别携带Wxa和wx等位基因的近等基因系Nip(Wxa)和Nip(wx)中。不同Wx等位基因背景中稻米理化品质和表达分析结果显示，抑制SSⅡ-2基因的表达在非糯背景中可协同调控直链淀粉和支链淀粉的合成进而改良稻米ECQ，在糯稻背景中仅能调控支链淀粉的合成优化稻米GT，表明Wx基因参与了SSⅡ-2RNAi转基因稻米的品质形成。本研究进一步通过CRISPR/Cas9技术创建了ssii-2、ssii-3单突变体和ssii-2ssii-3双突变体。分析结果显示，尽管ssii-2ssii-3突变体AC无显著降低，但其支链淀粉结构、GT和RVA谱均与SSⅡ-2RNAi转基因系高度相似，表明SSⅡ-3基因确实参与了SSⅡ-2RNAi转基因稻米的品质形成。因此，SSⅡ-2RNAi转基因稻米的ECQ显著提高是协同下调SSⅡ-2、SSⅡ-3和Wx三个基因的表达优化胚乳直链淀粉和支链淀粉合成的结果。
6.ssii-2突变体中稻米AC显著降低;在支链淀粉链长分布中，ssii-2突变体DP10-12和DP≥34链的比例较亲本对照略有增加，DP6-9和DP13-33链的比例略有减少，导致GT显著降低;SSⅡ-2突变后淀粉的晶体特性显著增加;SSⅡ-2突变后Wx基因和SSⅡ-3基因的表达均显著降低。这些结果表明SSⅡ-2在胚乳直链淀粉和支链淀粉合成中均发挥了重要作用，有望作为稻米ECQ和外观品质改良育种的新靶基因。