论文部分内容阅读
目的:本实验通过经典5/6肾切除术建立尿毒症SD大鼠模型,观察新型H2S供体AP39对实验性尿毒症SD大鼠心肌纤维化的影响,并进一步探讨其内在机制是否与线粒体自噬及心肌衰老有关。方法:48只同批次雄性两月龄SD大鼠适应喂养环境5天,通过随机数表法平均分入四个实验组中。组别分别为:空白对照组（CON）、尿毒症造模组（UCM）、AP39干预组（UCM+AP39）、AP39对照组（AP39）。UCM组、UCM+AP39组采用经典的5/6肾切除手术制作建立尿毒症大鼠模型,CON组、AP39组则只予行肾脏游离假手术作对照。术后4周开始药物干预实验,UCM+AP39组、AP39组给予AP39（50n M/kg/d）腹腔注射,UCM组和CON组大鼠则注射生理盐水对照,共干预4周后进行心脏彩超检测并查看各实验组大鼠心脏功能及结构改变,处死大鼠前称量各组大鼠的体重（BW）并采血检测大鼠血清尿素氮、肌酐以及尿蛋白/肌酐比以评估造模情况。充分麻醉并处死大鼠后,称取新鲜大鼠心脏质量（HW）,收集并分装各实验组心肌标本用于后续检测及对比:各组实验大鼠心肌胶原沉积情况用Masson染色检测比较,Ⅲ型胶原蛋白表达水平则采用免疫组化法检测比较,心肌衰老水平采用β-半乳糖苷酶染色法评估,线粒体自噬情况及线粒体微观结构则以透射电镜观察,CSE、TIMP2、MMP3、CollagenⅢ、LC3A/B、Beclin-1、Atg5、P53、P21、P16、BNIP3以及FUNDC1等蛋白的表达水平用蛋白免疫印迹实验检测。RT-q PCR检测BNIP3、LC3B、P53基因的相对含量。结果:1.各实验组大鼠一般情况及生化结果:较CON组而言,UCM组大鼠HW/BW增加并伴有BW的下降（P＜0.05）;而较UCM组大鼠相比,UCM+AP39组HW/BW有所下降（P＜0.05）,但BW差异不明显（P＞0.05）。在各组实验鼠的HW值对比统计未见显著性差异（P＞0.05）。UCM组、UCM+AP39组大鼠的血清肌酐、尿素氮及尿蛋白/尿肌酐值分别与CON组、AP39组比较,均明显上升（P＞0.05）;此外,较UCM组而言,UCM+AP39组大鼠的尿蛋白/尿肌酐值下降（P＜0.05）2.各实验组大鼠心脏彩超情况:相对CON组而言,UCM组大鼠心脏LVIDd（左心室舒张末期内径）及LVIDs（左心室收缩末期内径）显著扩大,同时LVFS（左室短轴缩短率）则明显下降（P＜0.05）;而UCM+AP39组与UCM组大鼠相比,LVIDd、LVIDs减低,LVFS可见回升（P＜0.05）。LVEF（左室射血分数）在CON组与UCM组之间以及AP39+UCM组与UCM组之间虽有差异,但未达显著统计学意义标准（P＞0.05）。3.各实验组大鼠心肌Masson染色情况:UCM组切片组织内被蓝染的部分较CON组而言增加且排列错乱,提示尿毒症环境下的大鼠发生心肌重构及纤维化;而UCM+AP39组较UCM组相比,实验大鼠心脏切片中被蓝染的部分可见减少,说明AP39干预可改善及缓解尿毒症环境下的心肌纤维化。4.各实验组大鼠心肌免疫组化结果:UCM组实验鼠心肌切片中CollagenⅢ的表达量比CON组增多,而相对UCM组而言,UCM+AP39组CollagenⅢ表达量下降,AP39组较CON而言则差异不明显。5.各实验组大鼠心肌透射电镜结果:UCM组大鼠较CON组而言,其心肌组织电镜视野下线粒体自噬少见且线粒体嵴普遍较为模糊;与UCM组比较,UCM+AP39组大鼠心肌组织电镜视野下线粒体自噬相对较多,且线粒体嵴相对完整。6.各实验组大鼠心肌β-半乳糖苷酶染色情况:UCM组较CON组蓝染部分增加,而较UCM组而言,UCM+AP39组染色则有减少趋势。7.各实验组大鼠心肌中相关蛋白表达情况:P16、P53、P21、MMP3、CollagenⅢ蛋白表达量在UCM组中显著高于CON组（P＜0.05）;而Atg5、LC3A/B、TIMP2、BNIP3、CSE、Beclin-1蛋白含量在UCM组中明显低于CON组（P＜0.05）。UCM+AP39组大鼠心肌组织中P53、P21、P16、CollagenⅢ、MMP3蛋白表达量较UCM组减少（P＜0.05）,而CSE、Beclin-1、Atg5、LC3A/B、TIMP2、BNIP3蛋白表达量较UCM组增加（P＜0.05）;但在UCM组与CON组以及UCM+AP39组与UCM组之间,未见FUNDC1蛋白表达具有统计学差异（P＞0.05）。AP39组与CON组相比,CollagenⅢ、MMP3、P53、P21、P16,CSE、Beclin-1、Atg5、LC3A/B、TIMP2、BNIP3、FUNDC1蛋白表达无显著统计学差异（P＞0.05）,（尽管BNIP3、LC3A/B的表达水平可能存在下降趋势）。8.各实验组大鼠心肌RT-q PCR检测结果:UCM组BNIP3及LC3B基因表达较CON组而言相对减少（P＜0.05）,而P53基因在UCM组的表达则较CON组则增多（P＜0.05）;UCM+AP39组较UCM组而言,BNIP3及LC3B基因表达上调,而P53基因表达则相对减少（P＜0.05）;以上三种基因在CON对照组与AP39对照组间大鼠心肌的检验差异则不显著（P＞0.05）。结论:线粒体靶向H2S供体AP39可缓解尿毒症所致的大鼠心肌纤维化,内在机制可能与其上调线粒体自噬及抑制心肌衰老有关。