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牡丹（tree peony）属于芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Sect.Moutan）,是原产于我国的多年生落叶小灌木,其籽油不饱和脂肪酸含量极高,其中α-亚麻酸（α-linolenic acid,ALA）含量高达40%以上,是兼具营养功能特性的重要园林花卉和药用植物。通常,植物油脂（TAG）生物合成的最后一步由二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）和磷脂:二酰基甘油酰基转移酶（PDAT）催化完成,DGAT和PDAT选择转移α-亚麻酸到甘油骨架上可直接影响植物油脂的成分和积累。结合已有报道和课题组前期研究显示油脂sn-3位很可能是牡丹α-亚麻酸的主要结合位点,那么DGAT和PDAT很可能参与了牡丹α-亚麻酸的高效积累。本研究在课题组紫斑牡丹（Paeonia rockii）种子不同发育时期相关转录组数据库的基础上,筛选出5个酰基转移酶基因。首先对这5个基因进行克隆和基本特性等分析,然后通过TAG合成缺陷性酵母的脂毒性恢复试验鉴定牡丹Pr DGATs和Pr PDATs的酶活性及脂肪酸选择偏好性;最后通过烟草瞬时转化、TRV-VIGS验证目标基因在α-亚麻酸积累中的作用,为揭示牡丹种子α-亚麻酸高水平积累分子机制提供依据,为牡丹油脂改良和分子育种提供优良基因。主要取得以下研究结果:1、从紫斑牡丹种子中克隆了DGAT、PDAT共5个二酰甘油酰基转移酶基因,分别命名为Pr DGAT1、Pr DGAT2、Pr PDAT1-1、Pr PDAT1-2和Pr PDAT2,其完整编码区序列长度为1554bp、981bp、2019bp、2028bp和2040bp,分别编码具有517、326、672、675和679个氨基酸残基的蛋白。它们都有一个保守结构域序列,其中Pr DGAT1的保守结构域属于跨膜-O-酰基转移酶超家族;Pr DGAT2的保守结构域属于溶血磷脂酰转移酶超家族;Pr PDAT1-1、Pr PDAT1-2和Pr PDAT2的保守结构域同属于磷脂酰胆碱固醇-O-酰基转移酶超家族。系统进化分析表明,牡丹DGAT1与油橄榄、油茶DGAT1同源性较高;牡丹DGAT2与栓皮栎、黧豆DGAT2同源性较高;牡丹PDAT1-1与葡萄、芝麻PDAT1同源性较高;牡丹PDAT1-2与可可、月季PDAT1同源性较高;牡丹PDAT2与中华猕猴桃和山杏PDAT同源性较高。这5个蛋白均定位于内质网。2、通过q RT-PCR试验发现在不同发育时期的牡丹种子中都能检测到5个基因的表达,但不同发育时期表达水平差异明显。Pr DGAT1、Pr DGAT2和Pr PDAT1-2基因的表达模式相似,Pr PDAT1-1基因在种子整个发育阶段相对表达水平较稳定,种子发育前期（S1-S3）只有Pr PDAT1-1基因相对高水平表达,发育后期（S4-S5）5个基因的相对表达水平均较高,表明种子发育后期（S4-S5）可能为油脂合成和α-亚麻酸的积累的关键时期。3、将Pr DGAT1、Pr DGAT2、Pr PDAT1-1、Pr PDAT1-2和Pr PDAT2在TAG生物合成有缺陷的四重酵母突变体（H1246）中表达,通过脂毒性恢复试验表明在酵母表达系统中,除牡丹PDAT1-1不具有酶活性外,其它四个酶均具有酶活性。其中,牡丹D GAT1可转移油酸（C18:1）、亚油酸（C18:2）和α-亚麻酸（C18:3）;牡丹DGAT2可转移亚油酸（C18:2）和α-亚麻酸（C18:3）;牡丹PDAT1-2选择转移油酸（C18:1）;牡丹PDAT2选择转移α-亚麻酸（C18:3）。4、在烟草叶片中瞬时表达牡丹Pr DGAT1、Pr DGAT2、Pr PDAT1-1、Pr PDAT1-2和Pr PDAT2基因,通过尼罗红染色来实现叶片中积累的油脂可视化,与空白对照叶片相比,瞬时表达Pr DGAT1、Pr PDAT2基因的叶片的油滴数显著增加。气相色谱仪对烟草叶片中脂肪酸含量进行测定结果显示,与空白对照叶片相比,瞬时表达Pr DG AT1烟草叶片的亚油酸（C18:2）、α-亚麻酸（C18:3）的相对含量增加,棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）的相对含量下降;瞬时表达Pr DGAT2烟草叶片的硬脂酸（C18:0）、α-亚麻酸（C18:3）的相对含量增加;瞬时表达Pr PDAT1-1烟草叶片的棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）的相对含量增加,亚油酸（C18:2）的相对含量下降;瞬时表达Pr PDAT2烟草叶片的油酸（C18:1）、α-亚麻酸（C18:3）的相对含量增加,其中Pr PDAT2对α-亚麻酸（C18:3）的相对含量增加的效果最为明显。5、为了在牡丹本体上反向验证Pr DGAT1、Pr DGAT2、Pr PDAT1-1、Pr PDAT1-2和Pr PDAT2基因在α-亚麻酸积累中的作用,建立了牡丹幼苗的VIGS体系,将连接有目的基因部分片段的TRV2-GFP载体真空渗透法瞬时转化牡丹。在紫外光的照射下,转化的牡丹叶片、根部呈现明显的绿色荧光,在激光共聚焦显微镜下均检测到GFP荧光,PCR也全部检测到叶片中的TRV1和TRV2-GFP的转录产物,q RT-PCR检测5个酰基转移酶基因表达水平相对空白对照叶片均大幅降低;利用气相色谱仪对牡丹叶片中脂肪酸含量进行测定,沉默Pr DGAT1叶片的α-亚麻酸（C18:3）的相对含量极显著降低;沉默Pr PDAT1-2叶片的油酸（C18:1）的相对含量显著降低,而α-亚麻酸（C18:3）的相对含量显著增加;沉默Pr PDAT2叶片的α-亚麻酸（C18:3）的相对含量极显著降低,而油酸（C18:1）的相对含量显著增加。综合以上试验结果,推断牡丹种子中高水平的α-亚麻酸含量与Pr DGAT1和Pr PDAT2酶对α-亚麻酸选择偏好性有直接关系,Pr DGAT1和Pr PDAT2基因在牡丹种子α-亚麻酸选择性转移过程中发挥了重要作用,并最终影响了α-亚麻酸的积累。