小麦TaEDS1的互作靶标验证及靶标基因Pst_R22的功能解析

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小麦条锈病由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striformis f.sp.tritici)导致,发病严重,分布范围广,威胁着我国乃至全世界的小麦生产安全。深入研究小麦条锈菌致病机理,对小麦条锈病的防控防治具有深远的影响。EDS1(enhanced disease susceptibility 1)是一个含有Lipase 3结构域的重要免疫节点蛋白,前期研究发现小麦基因TaEDS1在小麦抗条锈病中起重要作用,利用VIGS技术沉默TaEDS1后发现小麦对条锈菌CYR23抗病性减弱;通过酵母双杂得到了一个含有Lipase 3结构域的分泌蛋白Pst_R22。本论文在此基础上,进一步利用Co-IP技术验证了TaEDS1与Pst_R22的互作,解析了Pst_R22的功能。主要研究结果如下:1、TaEDS1在5A、5B、5D上共有3个拷贝,5种转录本。在5A、5B、5D各有一个长转录本,另外,在5A、5D还各存在一个短的转录本5A-like、5D-like,除了5A-like以外,其余4个转录本均含有Lipase 3结构域。利用Co-IP(Co-Immunoprecipitation)技术研究发现,除了5B上转录本以外,其余4个转录本均与Pst_R22存在互作,且Pst_R22与EDS1互作区域在EDS1的C端。2、亚细胞定位结果显示TaEDS1-5A、5B、5D定位在细胞质与细胞核;5A-like、5D-like主要定位在细胞质,细胞核定位较弱,与Pst_R22的定位一致;共定位显示Pst_R22不影响TaEDS1的定位。3、为验证Pst_R22是否编码分泌蛋白,利用酵母蔗糖酶缺陷体系证明了Pst_R22的信号肽具有分泌功能;同时,利用农杆菌在烟草中瞬时表达Pst_R22信号肽与GFP的融合蛋白,质壁分离后在原生质外观察到荧光,表明Pst_R22是一个分泌蛋白。4、为解析Pst_R22的毒性功能,在烟草中瞬时表达Pst_R22,发现Pst_R22可以抑制由BAX引起的细胞坏死;flg22处理本氏烟草叶片发现,Pst_R22可以抑制flg22激发的胼胝质积累,同时也抑制了TaEDS1增强的胼胝质积累。结果初步表明Pst_R22具有抑制植物免疫反应的毒性功能。5、qRT-PCR分析发现Pst_R22在条锈菌侵染前期上调表达,12 h时达到峰值,表明Pst_R22在条锈菌侵染小麦的早期发挥功能;为进一步鉴定Pst_R22在条锈菌致病中的作用,选取Pst_R22的特异片段作为靶点,创制了Pst_R22-RNAi的转基因植株。突变体植株接种小麦条锈菌毒性小种CYR31后发现产孢量减少;组织学观察发现侵染120 h时活性氧积累增加,菌丝生长发育减慢,表明Pst_R22在条锈菌的致病中发挥重要作用。综上所述,研究表明Pst_R22编码分泌蛋白,是条锈菌一个重要的致病因子,通过与TaEDS1互作,抑制了植物的PTI,从而促进条锈菌的侵染。
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