研究目的及背景随着我国大气污染形势的日益严峻,大气污染对健康的危害性逐渐被研究者所认识。除严重影响呼吸系统外,大气污染与心血管系统疾病的发生也密切相关。多个流行病学研究显示大气污染物浓度升高导致心血管患者发病率增高,住院和死亡人数明显增加[1,2],表明大气污染与心血管疾病的发生密切相关[2,3]。细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)是大气污染物中致病的主要成分,PM2.5与冠心病、动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的相关性已经得到流行病学的证实,并被确认是新的AS致病危险因子。对于PM2.5致AS的作用机制,以往认为其主要通过全身炎症性反应促进AS的发生,然而随着有研究证实PM2.5能跨过肺气-血屏障进入血液循环[4],其直接接触并损伤血管成为PM2.5致病机制的研究重点。目前对于PM2.5致AS的研究主要集中在其对血管内皮细胞的影响上,如损伤血管内皮细胞和引起炎症反应等[5]。致病因子活化血管平滑肌细胞,影响细胞的增殖和迁移能力是AS发生发展中的关键性环节[6],但目前关于PM2.5对血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cells,HVSMC)的影响机制尚未完全清楚。白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种天然多酚类植物抗毒素,广泛存在于多种药用植物中,已被报道发挥多种重要的药理作用用于不同疾病的防治。作为酚类化合物,白藜芦醇具可预防人类心血管疾病[7]。白藜芦醇不仅能调节脂质代谢,抑制低密度脂蛋白的氧化和血小板的聚集。还可以作为植物雌激素发挥其抗炎和抗氧化的特性。因此本实验首先用PM2.5直接染毒HVSMC,观察PM2.5对HVSMC增殖和迁移的影响,并从p38 MAPK和JNK途径探索其作用机制,揭示PM2.5的血管毒性作用和机制;然后研究白藜芦醇对PM2.5诱导的HVSMC增殖和迁移的影响,探讨其对心血管疾病的保护作用,为白藜芦醇应用于防治动脉粥样硬化等相关心血管疾病提供理论依据与实验支持。方法1.PM2.5对HVSMC的影响:实验分组为空白对照组、不同浓度的PM2.5组(其终浓度分别为 6.25 μ g/mL、12.5 μg/mL、25 μ g/mL)。通过 CCK-8 法和 EdU 染色法检测细胞增殖变化,通过划痕实验和Transwell法检测细胞迁移情况。2.PM2.5作用于HVSMC后相关通路蛋白表达:根据前期结果选取PM2.5最强作用浓度(12.5 μ g/mL)染毒细胞,用Western Blot法检测其对HVSMC细胞p38 MAPK和JNK信号分子磷酸化蛋白表达的变化。3.p38 MAPK和JNK在PM2.5致HVSMC增殖和迁移中的作用:用特异性抑制剂SB203580和SP600125预处理阻断p38 MAPK和JNK信号后,观察HVSMC细胞在PM2.5刺激下的增殖和迁移情况,以及细胞p38 MAPK和JNK信号分子磷酸化蛋白表达的变化。4.白藜芦醇对HVSMC的保护作用:实验分组分为对照组、PM2.5组(12.5 μ g/mL)、PM2.5+RES 组(RES 终浓度分别为 5 μ mol/L、10 μmol/L、20 μ mol/L),同样采用CCK-8和EdU法观察细胞增殖情况,Transwell和划痕实验观察细胞迁移情况。5.白藜芦醇保护PM2.5所刺激的HVSMC相关通路蛋白表达:实验分组分为对照组、PM2.5 组(12.5 μ g/mL)、PM2.5+RES 组(RES 终浓度分别为 5 μmol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L)。用Western Blot法检测其对HVSMC细胞p38 MAPK和JNK信号分子磷酸化蛋白表达的改变。结果1.(1)PM2.5对HVSMC增殖的影响:CCK-8和EdU检测结果显示在6.25-25 μ g/mL浓度范围内PM2.5染毒使HVSMC的增殖明显增加,与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。在浓度为12.5 μ g/mL时,PM2.5促HVSMC增殖能力与其他浓度组间存在显著性差异,提示PM2.5在浓度为12.5 μ g/mL时作用效果最强。(2)PM2.5对HVSMC迁移的影响:划痕实验结果显示PM2.5染毒组划痕面积在24h时明显较对照组减小,通过计算各组划痕愈合率发现PM2.5染毒组细胞划痕愈合率较对照组明显增加,二者比较有显著性差异(P<0.05);Transwell实验结果也显示PM2.5染毒后穿膜HVSMC细胞数显著增加,说明PM2.5染毒后细胞迁移能力增强,与划痕实验结果相一致。(3)Western blot法检测p38 MAPK和JNK的磷酸化水平:结果显示PM2.5染毒后HVSMC磷酸化蛋白含量显著增多,与对照组有显著性差异,说明PM2.5染毒可能是通过磷酸化激活p38 MAPK以及JNK信号分子使细胞增殖迁移,发生功能性改变。2.特异性抑制剂预处理对PM2.5染毒HVSMC的影响:我们用SB203580和SP600125预处理细胞,结果显示两种抑制剂的预处理可以显著降低PM2.5引起p38 MAPK和JNK磷酸化。CCK-8法验和Edu检测法结果显示,经过抑制剂预处理的两组细胞的增殖与PM2.5染毒组比较均有显著降低,说明阻断p38 MAPK与JNK信号途径皆减弱了 PM2.5促HVSMC增殖的效果。划痕实验和Transwell实验结果则显示抑制剂阻断两种信号通路后,PM2.5对HVSMC迁移能力的影响明显减小。结果提示p38 MAPK和JNK信号途径可能参与介导PM2.5促HVSMC细胞增殖和迁移过程。3.白藜芦醇对PM2.5染毒HVSMC的干预作用:通过CCK-8和EdU法检测白藜芦醇对PM2.5染毒的HVSMC增殖能力的影响,采用划痕实验和Transwell实验检测白藜芦醇对PM2.5染毒的HVSMC迁移能力的影响。结果提示白藜芦醇预处理可以抑制PM2.5染毒后HVSMC的增殖和迁移,随着药物浓度的增加,其抑制HVSMC细胞增殖和迁移的能力也随之增强,表明白藜芦醇可以对PM2.5诱导的HVSMC细胞增殖迁移影响起到保护作用。4.Western blot法检测白藜芦醇保护PM2.5染毒HVSMC的p38 MAPK和JNK磷酸化水平:结果提示白藜芦醇预处理组HVSMC细胞内磷酸化蛋白含量明显减少,具有显著性差异,说明白藜芦醇可以通过p38 MAPK和JNK信号途径抑制HVSMC细胞的增殖和迁移。结论1.PM2.5能够促进HVSMC的增殖和迁移。白藜芦醇预处理可以显著抑制这种病理改变,发挥保护作用。2.PM2.5可能通过磷酸化激活p38 MAPK和JNK信号通路发挥作用,而白藜芦醇预处理可以通过降低p38 MAPK和JNK磷酸化蛋白的表达抑制PM2.5对HVSMC细胞的毒性。