糖苷类化合物由糖基和苷元部分组成,广泛存在于植物体内,因其多样的生物活性而被广泛应用于医药、保健品以及化妆品等行业。根据苷元结构的不同,糖苷类化合物分为酚类糖苷、黄酮类糖苷、萜类糖苷等。酚类糖苷代表性化合物包括红景天苷、天麻素、豆腐果苷等,在临床上已展现重要的药用价值,具有保护神经,预防细胞缺氧损伤,抗炎,抗氧化等生物活性。然而,传统的从植物中提取酚类糖苷化合物的方法以及化学合成的方法步骤繁琐且效率低,远不能满足快速增长的药物需求。因此通过生物合成的策略,利用UDP-葡萄糖基转移酶（UDP-glucosyltransferase,UGT）构建高效的微生物细胞工厂成为更好的选择。本研究以酚类糖苷化合物为主要研究对象,设计构建了合成酚类糖苷的高效微生物细胞工厂,成功合成了 24种酚类糖苷化合物,并从中筛选得到了多种具有治疗神经性疾病潜力的候选药物,同时额外合成了 3种S-苷和2种N-苷。具体研究成果如下:为了筛选得到特异性催化烷基酚类化合物糖基化的高效UGTs,将从文献中查到的具有催化烷基酚糖基化潜能的8种UGTs进行蛋白表达纯化,然后以对羟基苯甲醇（1）为底物进行酶反应测试,筛选得到催化效率高且对酚羟基和醇羟基选择性不同的两种UGTs,RrUGT3和UGT85A1,它们分别特异性催化酚羟基和醇羟基的糖基化反应。为了研究两种UGTs的底物杂泛性,将两种UGTs基因分别整合至pCDFDuet-1载体,转化进大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,构建了两种高效表达UGTs的大肠杆菌细胞工厂,使用21种烷基酚类化合物、3种苯硫酚以及2种苯胺进行底物杂泛性测试。利用微生物细胞工厂批量转化底物,收集发酵液后通过大孔吸附树脂以及半制备液相色谱对产物进行分离纯化。经结构鉴定,共合成了 29种糖苷化合物,其中包括18种酚苷、4种醇苷、2种糖酯、3种S-苷和2种N-苷。将实验室前期开发的烷基酚氧化系统与UGTs相结合,构建了从烷基酚到氧化性酚类糖苷化合物的高效细胞工厂。在此过程中将以P450酶CreJ为核心催化剂的烷基酚氧化系统进行优化后整合至pRSFDuet-1载体上,然后与整合有UGTs基因的pCDFDuet-1载体共转化进大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,构建了从烷基酚底物合成氧化性酚类糖苷产物的大肠杆菌细胞工厂。同时利用CRISPR-Cas9技术将烷基酚氧化系统和UGT基因整合至大肠杆菌基因组上ushA基因位点。对比测试发现质粒系统的细胞工厂效率更高。由于得到的酚类糖苷产物结构与红景天苷、天麻素、豆腐果苷类似,且它们具有保护神经、预防老年痴呆等重要功能,于是针对治疗阿尔茨海默症等神经性疾病的常用靶点脯氨酰内肽酶（Prolyl endopeptidase,PEP）,对得到的酚类糖苷化合物进行PEP抑制活性测定,结果显示6种糖苷化合物的活性优于用于临床的红景天苷、天麻素和豆腐果苷。综上所述,本研究成功构建了合成酚类糖苷化合物的高效细胞工厂,为今后合成多种活性酚类糖苷创造了条件,同时表达RrUGT3的细胞工厂具有合成S-苷和N-苷的潜力,可用于合成活性S-苷和N-苷。值得一提的是,从获得的糖苷化合物中筛选得到了6种具有治疗老年痴呆症、阿尔茨海默症、帕金森病等神经类疾病潜力的候选药物,说明本研究可望为针对此类疾病的药物开发提供有力工具。