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目的:评价甘草-干姜“辛甘化阳”配伍治疗肺阳虚型哮喘的药效作用;探讨甘草-干姜“辛甘化阳”配伍治疗肺阳虚型哮喘的免疫分子机制;从能量代谢的角度探讨甘草-干姜“辛甘化阳”配伍原理内涵,进一步阐明甘草-干姜“辛甘化阳”配伍治疗肺阳虚型哮喘的可行性。方法:1采用UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS技术,在正、负离子模式下采集质谱数据,根据色谱保留时间以及质谱信息参照相关文献及标准品信息,对甘草-干姜化学成分进行来源归属,并对其主要成分进行定性分析。2将6~7周龄SPF级BALB/c雄性小鼠随机分为5组:正常组、模型组、甘草-干姜组(5.46g.kg-1)、干姜组(1.82g.kg-1)、沙丁胺醇组(0.78mg.kg-1)。利用屋尘螨(house dust mite,HDM)致敏外加烟熏、冰水游泳行为学干预制备肺阳虚型哮喘小鼠模型。2.1甘草-干姜配伍治疗肺阳虚型哮喘药效学研究:记录小鼠在不同实验阶段的体重,给药结束后观察小鼠的精神状态、活动情况、呼吸情况、皮毛状况、二便情况、饮食饮水量、口鼻处是否有分泌物、是否出现咳喘等肺系疾病特征;利用无创肺功能仪(NAM)测定小鼠特殊气道阻力(s Raw),评价小鼠的肺功能;利用HE染色和Masson染色法观察小鼠肺部炎症浸润及胶原沉积情况;使用全自动五分类动物血细胞分析仪对全血和肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞进行细胞计数;采用酶联免疫双抗体夹心法(ABC-ELISA)检测小鼠血浆中IgE表达水平;利用免疫组化法检测肺组织中α-SAM、TGF-β蛋白表达水平。2.2从能量代谢方面探讨甘草-干姜“辛甘化阳”配伍的原理内涵:采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测小鼠肺组织匀浆中Na+-K+ATP酶、Ga2+-Mg2+ATP酶和SOD表达含量。2.3甘草-干姜配伍治疗肺阳虚型哮喘免疫机制研究:采用ABC-ELISA检测BALF中Th1型细胞因子INF-γ和Th2型细胞因子IL-4表达水平;利用免疫组化法检测肺组织中Th17细胞转录因子RORγt和Treg细胞转录因子Foxp3蛋白表达情况;利用免疫荧光法检测小鼠肺组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达情况。结果:1甘草-干姜化学成分定性分析:通过对甘草-干姜主要成分进行分析共鉴定出58种物质,主要包括皂苷类、黄酮类、香豆素类、姜酚类,从相对含量来看其中主要有效成分为甘草苷、甘草酸、甘草皂苷、6-姜酚和姜酮。2甘草-干姜配伍治疗肺阳虚型哮喘药效学研究:与正常组比较,模型组小鼠出现躁动不安、抓挠头部、打喷嚏、呼吸急促等明显的过敏症状,且口鼻处有明显分泌物、身体发凉、常抱团蜷缩、体重明显降低;与模型组相比,甘草-干姜组小鼠症状有所改善,呼吸急促减轻,分泌物减少,体温升高,体重增加。各给药组之间相比较,西药组小鼠背温低于中药组,但在症状缓解方面3组小鼠无明显差异。造模前各组小鼠体重没有差异性;给药结束后,正常组小鼠体重持续增长,趋于稳定;模型组、甘草-干姜组、干姜组、沙丁胺醇组小鼠体重均有所增加;与模型组相比,甘草-干姜组、干姜组、沙丁胺醇组小鼠体重增加有显著差异(P<0.05),其中甘草-干姜组体重增加差异显著(P<0.05)。HE染色结果显示,模型组小鼠肺部病理切片出现明显炎性浸润,粘液分泌增多,气管管腔变窄;甘草-干姜和沙丁胺醇能够减轻小鼠气道炎症;Masson染色结果显示,模型组小鼠气道细胞外基质沉积明显增加,甘草-干姜能够减少哮喘小鼠气道细胞外基质沉积。ABC-ELISA结果表明,与正常组比较,模型组小鼠血浆IgE含量升高(P<0.05);与模型组比较,甘草-干姜组、干姜组和沙丁胺醇组IgE含量下降(P<0.05)。免疫组化研究结果显示,与正常组相比,模型组小鼠肺组织的α-SMA和TGF-β1的蛋白表达明显升高;与模型组相比,甘草-干姜组和沙丁胺醇组小鼠肺组织α-SMA和TGF-β的蛋白表达水平均有降低(P<0.05)。3甘草-干姜配伍对能量代谢酶的影响:与正常组相比,模型组小鼠肺组织中Na+-K+ATP酶、Ga2+-Mg2+ATP酶和SOD表达含量减少(P<0.05);与模型组相比,甘草-干姜、干姜和沙丁胺醇可提高肺组织中Na+-K+ATP酶、Ga2+-Mg2+ATP酶和SOD表达含量(P<0.05),其中甘草-干姜组优于沙丁胺醇组(P<0.05)。4甘草-干姜配伍治疗肺阳虚型哮喘免疫机制研究:与正常组相比,模型组小鼠肺组织RORγt蛋白表达升高(P<0.05),Foxp3蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,甘草-干姜能下调RORγt蛋白表达(P<0.05),上调Foxp3蛋白表达(P<0.05)。与正常组比较,模型组PI3K、Akt、mTOR蛋白表达量升高。与模型组比较,甘草-干姜、干姜和沙丁胺醇能降低PI3K、Akt、mTOR蛋白表达(P<0.05)。与正常组比较,模型组小鼠BALF中细胞因子IFN-γ表达水平下降(P<0.05),IL-4表达水平上升(P<0.05);与模型组相比,甘草-干姜能升高肺阳虚型哮喘小鼠IFN-γ表达水平,降低IL-4表达水平(P<0.05)结论:1本研究借助UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS技术,成功地对甘草-干姜主要化学成分进行了来源归属和定性鉴定,得出主要有效成分为甘草苷、甘草酸、甘草皂苷、6-姜酚和姜酮,与相关文献报道甘草和干姜治疗哮喘的有效成分一致,为揭示甘草-干姜治疗肺阳虚型哮喘提供了药效学物质基础。2甘草-干姜配伍可以显著改善肺阳虚型哮喘小鼠症状,减轻小鼠气道炎症反应,降低炎性细胞数量,改善小鼠体重,抑制小鼠气道重塑,缓解哮喘。3甘草-干姜“辛甘化阳”配伍原理内涵可能是通过增加肺阳虚型哮喘小鼠肺组织Na+-K+ATP、Ga2+-Mg2+ATP、SOD表达含量起到温补肺阳的目的。4甘草-干姜配伍治疗肺阳虚型哮喘免疫机制可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路调节免疫细胞失衡,表现为(1)调节Th1/Th2细胞失衡:促进Th1型细胞因子IFN-γ释放,抑制Th2型细胞因子IL-4释放。(2)调节Th17/Treg细胞失衡:上调Th17细胞转录因子RORγt表达,抑制Treg细胞转录因子Foxp3表达。