独一味总黄酮的提取纯化及抗炎抗氧化研究

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目的:本研究旨在确定独一味中总黄酮的最优提取方法,建立测定独一味中总黄酮含量的荧光分析法,为其质量控制和总黄酮提取工艺提供理论依据和科学的检测方法,采用大孔树脂纯化独一味总黄酮并进行抗炎抗氧化活性研究,以期为独一味的综合利用与开发提供参考。方法:1.对加热回流法、超声法提取独一味总黄酮进行了对比,以独一味总黄酮提取率为指标,通过响应面法优化各因素,最终确定最佳提取组合。2.黄酮类化合物可以与铝离子络合,形成具有荧光的络合物,以芦丁为标准品,响应面法优化荧光测定条件,建立起荧光法测定独一味中总黄酮含量的方法。3.采用大孔吸附树脂对独一味总黄酮进行纯化,考察6种树脂(AB-8、D-4020、D-101、HPD-100、HPD-300和HPD-500)对独一味总黄酮的静态吸附率和解吸率,筛选得最优型大孔吸附树脂。对上样液浓度、pH、上样量、洗脱剂浓度等因素进行考察,优化纯化工艺。4.以抗坏血酸VC为对照,通过研究独一味对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+·自由基的清除能力,来评价独一味总黄酮体外抗氧化能力。5.以二甲苯诱导的耳廓肿胀小鼠为炎症模型,考察研究独一味总黄酮提取物的体内抗炎活性作用,以小鼠耳廓肿胀度及肿胀抑制率为检测指标,来评价独一味总黄酮的体内抗炎效果。结果:1.乙醇回流提取独一味总黄酮的效果明显优于超声法,响应面优化得乙醇回流法提取独一味总黄酮的最佳工艺参数为:提取时间97 min,温度65℃,料液比1:15 g/mL,乙醇浓度75%,独一味总黄酮提取率7.872%。2.获得测定总黄酮含量最佳条件为:静置时间9 min,乙醇体积分数为90%、硝酸铝加入量为0.8mL,建立工作曲线(芦丁)的方程为y=157.28x+117.05,R2为0.9957,在0-2×10-2 mg/mL浓度范围内呈良好线性。荧光法测得独一味中总黄酮的含量为6.358±0.07 mg/g,相对标准偏差为1.1%,平均回收率在97.35%~101.5%之间,结果准确。3.六种大孔树脂中HPD-500型树脂纯化效果最好,树脂对总黄酮的最佳吸附参数为:上样液黄酮浓度为2.2 mg/mL,溶液pH值为5,上样量为20 mL;用60%的乙醇进行洗脱,解吸效果最好。此时独一味总黄酮的纯度为37.15%。4.独一味总黄酮清除DPPH自由基、羟自由基和ABTS+·自由基的能力与浓度呈正相关。对DPPH自由基的清除率IC50值为0.196 mg/mL,与VC的IC50值相当;当浓度为0.2-1.2 mg/mL范围内时,羟自由基清除率最高为72.39%,IC50值为0.468 mg/mL;当总黄酮浓度为0.12 mg/mL时,对ABTS+·自由基的清除率接近完全为99.35%,清除能力强于VC对照品。5.独一味总黄酮提取物高剂量给药组小鼠耳廓肿胀度为(1.10±0.927mg),明显低于空白对照组(4.05±0.141 mg),P=0.047<0.05,t=8.974,差异有统计学意义;高剂量组、中剂量组和低剂量组对小鼠耳廓肿胀的抑制率分别为63.46%、36.54%、21.48%;独一味总黄酮中剂量组和高剂量组的抗炎消肿作用与阳性组阿司匹林作用相当。结论:响应面法优化独一味总黄酮的提取工艺稳定可行;建立了荧光分光光度法测定独一味总黄酮含量,操作简便,且具有较高的精密度;大孔吸附树脂能有效提高独一味总黄酮纯度,为其药理活性研究奠定基础;独一味总黄酮具有较强的抗炎抗氧化活性,且药理活性与总黄酮浓度有一定的量效关系,具有临床研究和开发价值。
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