来源于芍药属中的芍药Paeonia lactiflora Pall.和牡丹Paeonia suffruticosa Andr.分别是中药白芍、赤芍和牡丹皮的原植物来源,这三种中药分别有补肝血、清热凉血及活血化瘀的功效。现代研究表明,芍药中的主要有效成分是芍药苷,具有显著的抗炎、镇痛、保肝等作用;牡丹中的主要有效成分是丹皮酚,具有抗炎、抗肿瘤、代谢调节等药理作用。芍药及牡丹在作为中药饮片的原植物来源,一般要三年以上才能满足药用要求,种植压力大;同时芍药及牡丹还要用于芍药苷和丹皮酚的提取,这种方式获取率低,对环境有一定的污染,对自然资源耗损量大,不符合中药资源可持续发展的要求。因此采用合成生物学策略,对中药活性成分生物合成途径进行解析,发掘其关键基因,设计和改造微生物菌株实现异源合成是一种极具潜力的资源获取方法。本研究通过对芍药和牡丹进行转录组测序,筛选并获得一系列可能参与芍药苷或丹皮酚生物合成的基因,首次发现并验证了一个参与丹皮酚生物合成的OMT基因,并对其功能特性进行研究。主要内容如下:1.基于芍药转录组筛选芍药苷生物合成相关基因本研究依据芍药苷结构特征及已报道的植物中可能存在的其他蒎烷型化合物,推测后续芍药苷生物合成途径为α-蒎烯在CYP450的催化下羟基化、环化生成去苯甲酰基芍药苷元,随后在UGT的催化下生成去苯甲酰基芍药苷,最后在AT的催化下生成芍药苷。为筛选推测的参与芍药苷生物合成的CYP450、UGT及AT基因,本课题组构建了二年生芍药花、叶、根三个部位的转录组数据库,转录组中共注释了 245条CYP450全长基因,105条UGT全场基因及128条AT基因。结合芍药苷在根中特异性积累及已经报道的参与芍药苷生物合成的萜类合酶PlPIN基因的表达模式对这些基因进行表达量分析,同时运用系统进化树分析筛选得11条CYP450基因、7条UGT基因及9条AT基因可能参与芍药苷的生物合成。本研究对二年生芍药花、叶、根三个部位进行转录组测序,通过化合物积累模式及上游基因表达模式进行表达量分析,同时联合系统进化树分析筛选出可能参与芍药苷生物合成的相关基因,大大减少后续基因功能验证的工作量。2.丹皮酚生物合成途径OMT基因功能验证及特性描述本研究推测丹皮酚生物合成途径为酪氨酸在解氨酶、β位氧化酶、脱羧酶、2’羟化酶及OMT的催化下生成丹皮酚。本课题组前期已获得二年生牡丹花期花、叶、根三个部位的转录组数据,转录组中注释得到26条OMT全长基因。丹皮酚在牡丹的根中差异性积累,通过基因表达量分析及系统进化树分析对牡丹转录组中的26条全长OMT基因进行筛选,筛选得到6条可能参与丹皮酚生物合成的OMT基因。从牡丹根的cDNA中成功扩增得到3条OMT基因并进行功能验证,发现2条OMT可催化2’,4’-二羟基苯乙酮生成丹皮酚。对催化活性较高的PsOMT2进行功能特性描述,其最适反应温度在28-37℃之间,在pH=8的NaH2PO3-Na2HPO3的缓冲溶液中,催化效率最高,在最适反应条件下Km值为30.21±1.90μM,转化率在75%左右。本研究对丹皮酚的生物合成途径进行合理地推测,明确了丹皮酚生物合成途径可能涉及的功能基因类型,鉴定了两个参与丹皮酚生物合成的OMT基因并进行功能特性描述,为后续丹皮酚的异源生物合成奠定了基础。