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研究背景针刺手法是发挥针刺疗效的重要手段。如何针对病症选用适当的针刺手法是针灸学科的关键科学问题。为了有效解析针刺手法的作用机制,本研究以踝关节炎模型大鼠为研究对象,探讨针刺捻转手法在抗炎镇痛方面发挥的作用。我们知道关节炎性疾病是针刺临床的常见病种,也是针刺研究领域用于探讨针灸镇痛作用机制的疾病模型之一。目前对于针灸抗炎镇痛方面的研究大多分别从外周或中枢的神经免疫调节的角度对其作用机制进行探析,而对于针灸同时对外周和中枢发挥神经免疫调节进而产生抗炎镇痛作用的研究还较少。本研究从腧穴部位、关节炎性病变局部以及它们对应的神经节段入手,从神经免疫学角度深入研究针刺捻转手法在改善踝关节炎模型大鼠病症方面的作用及其相关机制。研究目的本课题以完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）诱导的踝关节炎模型大鼠为研究对象,探析捻转针刺“解溪”穴（stomach meridian 41,ST41）对缓解踝关节炎模型大鼠炎性症状的作用。通过综合运用行为学、多重免疫荧光组织化学、神经示踪以及共聚焦显微镜成像技术,探析捻转针刺ST41穴位对外周踝关节周围组织中神经免疫成分表达的调节作用,以及从脊髓神经元、神经纤维、神经胶质细胞及炎性因子表达及形态变化,分析针刺踝关节炎模型大鼠病灶部位邻近穴位对关节炎症状的改善情况以及其外周-中枢调节路径。为进一步深入针灸抗炎镇痛外周机制研究提供数据支撑和参考。研究方法1观察正常、NaCl及7个不同时程CFA组大鼠行为学变化具体分为9组,每组8只大鼠。正常组:未接受任何干预。NaCl组:在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露大鼠左侧踝关节,使其后肢足掌背伸位,抬高其左侧后肢,定位后用微量注射器将50μ10.9%的NaCl溶液从足底足垫部注入踝关节及其周围组织。CFA模型组:模型组共56只大鼠,分为6小时（hour,h）、24h、2天（day,d）、3d、5d、7d及14d共7个观察时间点,即7组,每组8只,同样大鼠在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露左侧踝关节,体位与定位方法与NaCl组相同,并用微量注射器将50μl CFA溶液从足底足垫部注入踝关节。造模前,随机在CFA各组中选取8只大鼠进行热辐射痛、机械痛、肿胀度以及周长测量作为CFA的0h组,随后正常组、NaCl组在造模后6h、24h、2d、3d、5d、7d及14d进行上述行为学检测,CFA组造模后的6h、24h、2d、3d、5d、7d及14d组在各时间点完成检测。2观察踝关节炎模型大鼠造模区域以及ST41穴的神经支配特征选用2只正常SD大鼠,分别进行示踪剂霍乱毒素亚单位B（cholera toxin subunit B,CTB）注射以及荧光素化的 CTB（Alexa Fluor CTB,CTB-AF）488/594注射,各取1只大鼠。CTB注射组:在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露大鼠双侧踝关节,用微量注射器将5μl 1%CTB溶液注入左侧ST41穴区皮下及肌肉组织中;另将5μl 1%CTB从大鼠右侧足底足垫部进针注射入踝关节,注射方法同CFA模型造模方法。CTB-AF488/594注射组:在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露大鼠双侧踝关节,用微量注射器吸取5μl 0.1%CTB-AF 488从左侧足底足垫部进针并将药物注入左踝关节,同时,另用微量注射器吸取5μl 0.1%CTB-AF 594注入左侧ST41穴区皮下及肌肉组织。大鼠右侧后肢CTB-AF 488/594注射操作同左侧。造模部位注射示踪剂方法同CFA模型造模方法。2只大鼠均在示踪剂注入后按常规饲养条件饲养3d,随后进行灌流取材。采用4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）溶液对大鼠进行经心脏灌流,固定全身组织,然后取出脊髓、腰（lumbar,L）2-骶（sacral,S）1节段脊神经节（dorsal root ganglion,DRG）、脑干,经4%PFA溶液后固定2h,随后放于25%蔗糖溶液中脱水24h后,用平推冰冻切片机进行切片,切片厚度均为40mm,后进行荧光免疫组织化学染色观察。3比较正常、NaCl及7个不同时程CFA组大鼠关节周围组织、DRG以及脊髓神经化学成分变化根据上述7组不同时程CFA大鼠的行为学检测情况,选择其中的4组具有代表性的时程组大鼠,以及正常组和NaCl组大鼠,在其行为学检测结束后立即进行灌流取材。正常组取任意一侧ST41穴区皮肤及皮下关节周围组织、脊髓、DRG,NaCl及CFA组取造模侧对应组织。其中脊髓和DRG选取节段依据前示踪剂注射部分实验结果。随后经后固定、脱水等步骤后将组织制成切片。通过免疫荧光组织化学染色方法,分析上述取材组织中的神经化学成分以及免疫细胞等的表达情况。其中,关节周围组织片选择观察指标包括:P物质（SubstanceP,SP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）、类胰蛋白酶（Tryptase）、溶酶体关联膜蛋白（Lysosomal associated membrane,LAMP）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factorα,TNFα）、CD11b;DRG组织观察指标包括SP、CGRP;脊髓组织的观察指标包括 SP、CGRP、离子钙接头结合蛋白 1（Ionized calcium binding adapter molecule-1,Iba1）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）。4观察捻转针刺对踝关节炎模型大鼠行为学改善作用具体分为4组,每组8只大鼠。NaCl组:在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露大鼠左侧踝关节,用微量注射器将50 μ1 0.9%NaCl溶液从足底足垫部注入踝关节,随后不予以针刺干预。CFA组:在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露大鼠左侧踝关节,用微量注射器将50 μl CFA溶液从足底足垫部注入踝关节,随后不予以针刺干预。CFA+捻转针刺（twisting acupuncture,CFA+TA）组:在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露大鼠左侧踝关节,使背伸抬高,用微量注射器将50μl CFA溶液从足底足垫部注入踝关节造模,在注射后6h、24h及48h时均进行针刺患侧ST41穴位,针刺30分钟（minute,min）,在进针和出针时进行捻转手法操作,且每隔10min进行均匀捻转,每次捻转1min。CFA+留针（acupuncture,CFA+A）组:在异氟烷呼吸麻醉状态下,暴露大鼠左侧踝关节,使背伸抬高,用微量注射器将50μl CFA溶液从足底足垫部注入踝关节,在注射后6h、24h及48h时也对患侧ST41穴位进行针刺干预,采用直刺进针,且进针后不采取任何手法干预,留针30min。以上4组,在造模前,以及造模后6h、24h及48h时干预结束后进行热痛阈、机械痛阈、足肿胀及周长检测。5观察捻转针刺对踝关节炎模型大鼠局部组织、DRG和脊髓相关神经和化学物质表达影响上述4组大鼠在完成最后一次行为学检测后,立即进行灌流取材。用4%PFA溶液依前法进行经心脏灌流固定,取大鼠患侧ST41穴区皮肤及关节周围组织、脊髓、DRG,进行后固定、脱水、切片及免疫荧光组织化学染色。比较4组大鼠以上组织中神经化学成分及免疫细胞相关物质表达的变化,观察指标包括:SP、CGRP、Tryptase、LAMP、CD11b、TNF-α、Iba1、GFAP。研究结果1正常、NaCl及7个不同时程CFA组大鼠行为学变化造模前,随机选取8只CFA组的大鼠作为0h组,与正常组、NaCl组一起进行0h行为学检测;造模后,在6h、24h、2d、3d、5d、7d及14d进行上述行为学检测。结果显示,CFA模型组大鼠踝关节周长在各时程均高于正常组和NaCl组,且经统计学比较显示其差异显著（P＜0.05）;同时在以上各个时程测量大鼠造模侧足肿胀度提示,CFA组大鼠踝关节在24h、2d、3d及7d时与正常组比较相对肿胀（P＜0.05）,而与NaCl相比则在24h、2d、及7d时有显著差异（P＜0.05）。就CFA模型各时程组而言,在造模后24h及2d组大鼠踝关节周长相较于6h组大鼠周长较长,且经统计学分析其差异明显（P＜0.05）。此外,在6h、24h、2d、7d及14d组大鼠足爪肿胀度测量结果与0h组相比均较高,且差异有统计学意义（P＜0.05）。CFA组大鼠的机械痛、热辐射痛阈指标,即大鼠缩足反应时间（S）在造模后呈现逐渐缩短的趋势。其中,热辐射痛阈值在6h及2d时与正常组相比差异显著（P＜0.05）,在6h、24h及2d时与NaCl组相比差异显著（P＜0.05）。CFA模型大鼠各时程机械痛阈中6h组与3d、5d、14d组相比差异明显（P＜0.05）,6h和24h组与0h差异显著（P＜0.05）。各时程热辐射痛阈中6h组与3d、5d、7d、14d组大鼠相比有明显差异（P＜0.05）,6h、24h、2d及3d组与0h相比差异显著（P＜0.05）。2踝关节炎模型大鼠造模区域以及ST41穴的神经支配特征将CTB分别注射到大鼠双后肢一侧ST41穴及一侧足底足垫部注射部位后,切片观察显示,CTB标记的与上述两部位相关的感觉神经元在DRG的分布主要集中于L3-L5节段;其中ST41穴位相关感觉神经元在L4节段分布最多,足底足垫部注射部位相关感觉神经元在L5节段分布最多。此外,与上述部位相关的感觉神经纤维轴突终末投射在L4节段脊髓背角的分布位置和数量近似,在脑干主要投射于薄束核,且分布位置与数量相近。而与足底足垫部注射部位相关的运动神经元在脊髓的平均分布数量明显高于ST41穴位相关的运动神经元数量。在大鼠后肢同侧两部位注射CTB-AF 594/488后,切片观察显示,两部位相关的感觉神经元分布有部分共染,而在脊髓前角的运动神经元的分布尚未见共染。3正常、NaCl及7个不同时程CFA组大鼠关节周围组织、DRG以及脊髓神经化学成分变化在通过CFA诱导造模后6h～3d时,与正常组和NaCl组相比,模型大鼠踝关节周围组织中SP和CGRP阳性表达神经纤维表达明显增多,随着时间的推移其表达呈现减少趋势;同时,组织中Tryptase标记的静息状态的肥大细胞表达减少,LAMP标记的激活状态的肥大细胞表达明显增多,其中在造模后2d时激活状态的肥大细胞表达最多,随后逐渐减少;而组织中的5-HT的阳性表达在造模后6h最多,随后逐渐减少;此外,炎症相关因子CD1 1b与TNF-α表达在造模后呈现为在2d和3d时增多的趋势。相对于正常组与NaCl组大鼠而言,踝关节炎模型大鼠其DRG中SP和CGRP阳性表达神经元在造模后2d时明显增多,且SP阳性神经元数量多于CGRP阳性神经元数量,且各组脊髓背角中SP和CGRP表达阳性表达神经纤维终末分布规律与之呈现一致性。此外,脊髓中的神经胶质细胞如Iba1标记的小胶质细胞在造模后2d时可见明显的激活,其形态特点为:胞体变大,轴突短粗。4捻转针刺对踝关节炎模型大鼠行为学结果的影响分别对NaCl组、CFA组、CFA+A组以及CFA+TA组在造模前、造模后6h、24及2d时针刺干预结束后进行相应的行为学检测。其中造模前各组机械痛阈、热辐射痛阈、踝关节周长及足肿胀度测量结果差异均无统计学意义（P＞0.05）;造模后,CFA组大鼠各项行为学检测指标与NaCl组相比均明显改变,且差异有统计学意义（P＜0.05）。在6h时,CFA+A组及CFA+TA组大鼠机械痛阈和热辐射痛阈测量结果与NaCl组相比明显降低,经统计学检验显示其差异明显（P＜0.05）;CFA+A组与CFA组大鼠患者踝关节周长相比差异明显（P＜0.05）,CFA+A组及CFA+TA组相比差异也具有统计学意义（P＜0.05）;在24h时,CFA+A组与CFA+TA组大鼠机械痛阈有所提高,但与NaCl组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;CFA+A组与NaCl组相比热辐射痛阈测量结果差异有统计学意义（P＜0.05）,而CFA+TA组大鼠热辐射痛阈与NaCl进行比较其差异不显著（P＞0.05）。在造模后2d时,CFA组与CFA+A组大鼠机械痛阈与NaCl组相比差异显著（P＜0.05）,而CFA+TA组大鼠机械痛阈较前虽无显著提升,但与CFA组相比差异显著（P＜0.05）;CFA+TA组大鼠热辐射痛阈较前有所提高,与CFA组相比差异明显（P＜0.05）;CFA+TA组大鼠患侧踝关节周长均值明显降低,与CFA+A组相比差异显著（P＜0.05）,CFA+TA组大鼠患侧足肿胀度与CFA组相比差异显著（P＜0.05）。5捻转针刺对模型大鼠关节周围组织、DRG和脊髓相关神经和化学物质改善情况造模后2d,大鼠踝关节周围组织中SP和CGRP 阳性表达神经纤维数量与NaCl组相比增多,CFA+A组与CFA组相比表达较少,而CFA+TA组表达减少明显;关节周围组织中LAMP标记的激活型的肥大细胞在CFA造模后2d时表达明显增多,且部分细胞呈现聚集状态,同时Tryptase标记的静息态肥大细胞表达明显减少,CFA+TA组与CFA+A组相比无明显差异;组织中的5-HT在造模后2d时较NaCl组表达数量显著升高,CFA+TA组5-HT表达与其它3组相比显著减少;此外,组织中炎性因子CD11b和TNF-α在造模后2d较NaCl组表达显著增多,而针刺组表达均明显减少,而其中CFA+TA组减少显著。DRG中的SP与CGRP阳性表达神经元数量在造模后均增加,针刺组与CFA组相比有所减少,CFA+A组较CFA+TA组数量减少。CFA模型组造模后2d,脊髓背角中SP与CGRP阳性表达神经纤维终末分布数量稍有增多,CFA+TA组相对减少。此外,脊髓节段中Iba1标记小胶质细胞在造模后2d时呈现明显激活状态,CFA+TA组小胶质细胞活化减弱,而CFA+A组小胶质细胞活化明显。结论1 CFA用于诱导大鼠踝关节炎模型造模,在2d时大鼠患侧关节炎症状态明显。2针刺病灶局部穴位可提高踝关节炎模型大鼠的痛阈,并改善踝关节炎大鼠患侧关节肿胀的情况,且捻转针刺组优于留针组。3针刺病灶局部穴位可减少踝关节炎模型大鼠关节外周组织中SP和CGRP阳性神经纤维、LAMP标记激活型肥大细胞、5-HT、CD11b、TNF-α的表达,并抑制DRG及脊髓相应节段中相关阳性纤维和小胶质细胞激活,从而改善大鼠踝关节炎症状态。