第一部分CD82在小鼠急性高眼压模型导致的视神经轴突转运障碍中的作用研究目的:目前针对青光眼视神经损伤的有效治疗手段有限,青光眼视神经病变的具体机制尚不明确。轴突转运障碍是青光眼视神经损伤的极早期病变,及时干预高眼压损伤造成的视神经轴突转运障碍能够有效缓解视神经轴突损伤及RGCs死亡的结局。CD82分子属于四跨膜蛋白超家族重要成员,参与细胞骨架调节并与细胞内多条信号通路存在相互作用,广泛参与细胞内多种生理功能的调节,目前对于CD82在视网膜中的作用鲜有文献报道。本章研究旨在观察小鼠急性高眼压（acute ocular hypertension,AOHT）模型中视神经轴突转运障碍的特点及CD82的表达模式,探究过表达CD82对AOHT模型中损伤早期的视神经轴突转运障碍及随后的轴突变性、神经节细胞死亡的结局是否具有保护作用。方法:本研究采用前房生理盐水高压灌注法构建C57BL/6小鼠急性高眼压模型,于造模后8小时、1天、2天、3天和7天取材。利用玻璃体腔注射荧光标记的霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B,CTB）及视盘处突触素蛋白的免疫荧光染色、western-blot检测评估视神经轴突转运功能;应用组织切片免疫荧光染色及western-blot实验检测CD82的表达变化;通过玻璃体腔注射CD82-重组腺相关病毒（AAV-CD82）诱导小鼠眼球组织中CD82过表达,检测AOHT模型各时间点视神经对CTB及突触素的轴突转运情况;利用透射电镜成像、Aβ免疫组化染色评估视神经轴突变性情况;利用视网膜铺片Tuj1及Rbpms免疫荧光染色评估神经纤维及RGCs的数量;体外实验使用维甲酸诱导分化的SH-SY5Y细胞及原代海马神经元,利用过氧化氢（H2O2）制造神经突损伤模型,进行CD82过表达质粒转染验证其对体外培养的神经源性细胞神经突损伤的保护作用。结果:成功构建小鼠AOHT模型,可观察到轴突转运障碍表现为CTB在视神经内转运距离缩短,突触素在视盘处堆积。轴突转运障碍在AOHT模型后8小时开始出现,2天时最为明显,7天时有所恢复;在AOHT模型后8小时至2天内CD82的表达量逐渐减少,3天及以后表达量有轻度恢复;AAV-CD82注射后,AOHT造模后各时间点视神经对CTB及突触素的轴突转运障碍情况明显减轻。AOHT模型后7天电镜显示视神经结构明显破坏,Aβ免疫组化阳性染色增加,视网膜铺片中神经纤维及RGCs计数明显减少;CD82过表达后,上述轴突变性及RGCs丢失情况明显缓解。体外实验显示,H2O2损伤模型诱导SH-SY5Y细胞及原代海马神经元神经突长度缩短,CD82过表达对该损伤具有保护作用。结论:视神经轴突转运障碍在AOHT模型极早期即出现,后逐渐加重,在损伤晚期有轻度自发性恢复;CD82的表达量随造模后观察时间的延长先下调后轻度上调,与轴突转运障碍的时空特点具有相关性;CD82过表达对AOHT模型引起的视神经轴突转运障碍及随后出现的轴突变性、RGCs丢失具有缓解作用。第二部分CD82通过激活mTORC1通路改善小鼠AOHT模型中视神经的轴突转运障碍目的:mTORC1通路对于维持神经细胞的正常生理功能至关重要。mTORC1通路与视神经损伤密切相关,mTORC1通路的激活对损伤条件下RGCs的存活及轴突的再生均具有促进作用。有研究提示四跨膜蛋白与mTORC1通路之间存在关联,但二者在视神经病变中的相互作用尚不明确。本章研究旨在阐明CD82视神经保护作用的分子机制,探究其是否通过激活mTORC1通路而发挥神经保护作用。方法:使用HEK-293T细胞作为分子机制研究的工具细胞,利用H2O2诱导细胞损伤并进行CD82过表达质粒转染,利用western-blot实验检测mTORC1通路下游底物p70S6K的磷酸化水平;利用mTORC1通路特异性抑制剂雷帕霉素处理细胞后,进行western-blot实验检测CD82过表达对p70S6K磷酸化水平的影响;动物实验选取AOHT模型后2天为观察点,通过玻璃体腔注射AAV-CD82实现眼球组织中CD82的过表达,利用视网膜铺片免疫荧光染色检测mTORC1通路下游底物p-S6的激活情况;采用两种方法在体干预mTORC1通路的激活:小鼠腹腔注射抑制剂雷帕霉素及利用Rptorfl/fl转基因小鼠玻璃体腔注射AAV-hsyn-Cre构建神经节细胞特异性敲低Raptor的模型鼠靶向抑制mTORC1通路。干预mTORC1通路后,利用p-S6和Tuj1的免疫荧光共染色反映RGCs中mTORC1通路的激活情况;利用玻璃体腔注射CTB及组织切片突触素的免疫荧光染色评估干预mTORC1通路后视神经的轴突转运功能。结果:在HEK-293T细胞中,western-blot结果显示H2O2刺激引起mTORC1通路下游底物p70S6K磷酸化减少,过表达CD82能够逆转H2O2损伤导致的p70S6K磷酸化水平的下降;使用抑制剂雷帕霉素干预细胞后,CD82对p70S6K磷酸化的上调效应被阻断;在小鼠AOHT模型中,Tuj1染色阳性的RGCs中p-S6的免疫荧光染色较假手术组明显减少,过表达CD82后p-S6的阳性染色有所增加,但应用雷帕霉素抑制剂后,CD82对p-S6的激活效应消失;在Raptor特异性敲低的小鼠模型中,CD82过表达对AOHT损伤导致的轴突转运障碍的保护作用显著减弱。结论:在离体细胞及在体动物实验中,损伤模型均会诱导mTORC1通路的失活;CD82过表达能够逆转损伤导致的mTORC1通路的失活;CD82过表达通过激活mTORC1通路而对视神经轴突转运障碍起到保护作用。第三部分CD82通过上调TRAF2而激活mTORC1通路发挥神经保护作用目的:CD82属于跨膜蛋白,而mTORC1是胞内重要的信号枢纽,二者之间并不存在直接结合。前文研究已证实CD82过表达对mTORC1通路具有激活作用,但其激活mTORC1通路的方式仍有待进一步探索。本章研究旨在阐明CD82激活mTORC1通路的分子机制:寻找CD82激活mTORC1通路的中间分子;验证CD82通过中间分子TRAF2介导mTORC1通路的激活并探索TRAF2调节mTORC1通路活性的具体机制。方法:利用生物信息学技术借助蛋白互作网络数据库寻找CD82与mTORC1的关联分子;在HEK-293T细胞中,利用H2O2诱导细胞损伤模型并进行CD82过表达质粒转染,利用RT-PCR及western-blot实验检测中间分子TRAF2的表达水平;动物实验选取AOHT模型2天组视网膜切片进行免疫荧光染色验证TRAF2的表达;在HEK-293T细胞中,利用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）抑制TRAF2的表达后,进行western-blot实验检测p70S6K磷酸化水平;利用免疫共沉淀技术检测TRAF2与Raptor的结合;干扰TRAF2后利用免疫沉淀及western-blot实验检测Raptor的K63泛素化水平;应用细胞免疫荧光染色检测Raptor与溶酶体标志物Lamp1的共定位;对诱导分化的SH-SY5Y细胞及原代海马神经元进行TRAF2的干扰及CD82过表达,用H2O2诱导细胞损伤并观察其神经突生长情况。结果:蛋白互作网络数据库提示TRAF2与CD82和mTORC1的综合关联性最强。在HEK-293T细胞中,RT-PCR及western-blot结果显示H2O2刺激引起TRAF2的m RNA水平及蛋白水平下调,过表达CD82能够逆转H2O2损伤导致的TRAF2表达水平的下降;在小鼠AOHT模型中,造模组的视网膜神经节细胞层中TRAF2免疫荧光阳性染色较假手术组明显减少,过表达CD82后,造模引起的TRAF2的下调有所恢复。干扰TRAF2后,过表达CD82对p70S6K磷酸化水平的上调作用消失;免疫共沉淀实验显示TRAF2与Raptor存在互相结合,且干扰TRAF2后,Raptor的K63泛素化修饰减少,与Lamp1的免疫荧光共定位也减少;SH-SY5Y细胞及原代海马神经元神经突生长实验显示干扰TRAF2后,CD82过表达对神经突生长的促进作用消失。结论:CD82过表达能够上调TRAF2的表达水平;TRAF2通过催化Raptor的K63泛素化修饰并增加其溶酶体定位而介导mTORC1通路的激活;CD82通过上调TRAF2介导mTORC1通路的激活而发挥神经保护效应。