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目的:研究姜黄素对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH、SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、ROS生成、内质网应激及自噬的影响,初步探讨姜黄素通过诱导ROS生成对SK-N-SH、SH-SY5Y细胞增殖、凋亡及内质网应激及自噬活动的分子机制。方法:(1)课题组选取SK-N-SH、SH-SY5Y细胞为研究对象,以不同浓度姜黄素(0、1.25、2.5、5、10、15 μmol/L)作用于细胞,采用CCK-8法检测姜黄素对SK-N-SH、SH-SY5Y细胞的抑制率及半数抑制浓度(IC50)。随后设置实验分组:空白组(control)、姜黄素1/2 IC50、IC50、2 IC50组,不同药物浓度分别作用于SK-N-SH、SH-SY5Y细胞,通过CCK-8法检测不同浓度姜黄素对细胞的抑制率;采用流式细胞术检测不同浓度姜黄素对细胞凋亡、细胞周期及ROS荧光强度的影响;试剂盒检测MDA活性;采用 Real-time qPCR 实验(RT-qPCR)检测细胞 Grp78、CHOP mRNA表达;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞Caspase-3、cleaved Caspase-3、cyclinA2、p21、Grp78、CHOP、cleaved caspase-12、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3 Ⅰ蛋白表达;通过免疫荧光技术观察p62和LC3的定位情况。(2)课题组选取SK-N-SH、SH-SY5Y细胞为研究对象,将实验分组为:空白组(control)、姜黄素组(IC50)、NAS(ROS清除剂)组(5 mmol/L)、姜黄素+NAC(IC50+5mmol/L)。应用CCK-8检测细胞抑制率;流式细胞术检测细胞细胞凋亡率;Western blot检测细胞Grp78、CHOP、Beclin-1、cleaved caspase-12、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表达。结果:(1)CCK-8结果表明:不同浓度姜黄素(0、1.25、2.5、5、10、15μmol/L)作用SK-N-SH、SH-SY5Y细胞后,细胞增殖被抑制,且抑制作用呈浓度依赖性,姜黄素对SK-N-SH、SH-SY5Y细胞的IC50值分别为 13.251、12.387 μmol/L。NAC、姜黄素组、姜黄素+NAC 作用 SK-N-SH、SH-SY5Y细胞后,与NAC组相比,姜黄素+NAC组SK-N-SH、SH-SY5Y细胞抑制率显著升高(P<0.01)。(2)流式细胞及MDA活性结果表明:姜黄素1/2 IC50、IC50、2IC50作用SK-N-SH、SH-SY5Y细胞后,与control组相比,姜黄素1/2IC50组、IC50 组、2IC50 组 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。姜黄素2IC50组SK-N-SH细胞G2/M期细胞明显增加(P<0.01)。姜黄素l/2IC50 组、IC50 组、2IC50 组 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞 ROS 荧光强度显著增加、MDA活性显著降低(P<0.01)。NAC、姜黄素组、姜黄素+NAC作用SK-N-SH、SH-SY5Y细胞后,与NAC组相比,姜黄素+NAC组SK-N-SH、SH-SY5Y细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。(3)qRT-PCR检测结果表明:姜黄素1/2 IC50、IC50、2IC50作用SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞后,与 control 组相比,姜黄素 IC50 组、2IC50组 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞 Grp78、CHOP mRNA 表达显著增加(P<0.05)。(4)Western blot检测结果表明:姜黄素1/2 IC50、IC50、2IC50作用SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞后,与 control 组相比,姜黄素 IC50 组、2IC50组 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞中 cleaved Caspase-3、p21、Grp78、CHOP、cleaved caspase-12、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 蛋白表达显著增加(P<0.05);姜黄素 IC50 组、2IC50 组 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞中 cyclinA2、LC3Ⅰ蛋白表达显著降低(P<0.05)。NAC、姜黄素组、姜黄素+NAC作用SK-N-SH、SH-SY5Y细胞后,与NAC组相比,姜黄素+NAC组SK-N-SH细胞CHOP蛋白表达显著升高,SH-SY5Y细胞Grp78、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.05),SK-N-SH、SH-SY5 Y 细胞 cleaved caspase-12、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显著增加(P<0.05),LC3Ⅰ蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。(5)免疫荧光结果显示:姜黄素1/2 IC50、IC50、2IC50作用SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞后,与 control 组相比,姜黄素 IC50、2IC50 组 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞 LC3 表达显著上调(P<0.05),姜黄素1/2IC50、IC50、2IC50组SH-SY5Y细胞p62表达明显降低(P<0.05)。结论:(1)人神经母细胞瘤SK-N-SH、SH-SY5Y细胞增殖可被姜黄素明显抑制,且抑制作用呈现浓度依赖性,并诱导了 SK-N-SH、SH-SY5Y细胞凋亡,下调SK-N-SH、SH-SY5Y细胞中cyclinA2蛋白表达及上调SK-N-SH、SH-SY5Y细胞中p21蛋白表达。在姜黄素(IC50、2IC50)处理后,SK-N-SH、SH-SY5Y细胞ROS荧光强度明显升高,可促进细胞Grp78、CHOP、cleaved caspase-12、及 Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达。(2)姜黄素可通过上调ROS生成抑制SK-N-SH、SH-SY5Y细胞增殖、诱导 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞凋亡、促进 SK-N-SH、SH-SY5Y 细胞内质网应激及自噬。