【摘 要】
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背景和目的骨肉瘤是最常见的骨原发性高度恶性肿瘤,严重危害儿童和青少年健康。易发生早期转移,治愈率低且死亡率高,预后不良。目前骨肉瘤的治疗以新辅助化疗+手术+辅助化疗为主,治疗效果较之前有所改善,但仍存在肿瘤细胞耐药、术后复发及远处转移现象,导致整体疗效不佳。由于骨肉瘤病因复杂,缺乏有效的治疗靶点,骨肉瘤5年内死亡率持续在40%以上。虽然有几种抗癌药已应用于临床,但骨肉瘤复发、转移的情况在过去的40
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背景和目的骨肉瘤是最常见的骨原发性高度恶性肿瘤,严重危害儿童和青少年健康。易发生早期转移,治愈率低且死亡率高,预后不良。目前骨肉瘤的治疗以新辅助化疗+手术+辅助化疗为主,治疗效果较之前有所改善,但仍存在肿瘤细胞耐药、术后复发及远处转移现象,导致整体疗效不佳。由于骨肉瘤病因复杂,缺乏有效的治疗靶点,骨肉瘤5年内死亡率持续在40%以上。虽然有几种抗癌药已应用于临床,但骨肉瘤复发、转移的情况在过去的40年里一直少有突破。因而,如何克服化疗药物耐药性,研究骨肉瘤细胞抵抗凋亡相关分子机制,对探索骨肉瘤的有效的治疗方法,改善患者预后具有重要意义。溴结构域蛋白4（Bromodomain-containing Protein 4,BRD4）是具有重要表观遗传调控功能的肿瘤相关蛋白,能够作为表观遗传阅读器选择性识别组蛋白尾部乙酰化赖氨酸残基,并且溴结构域蛋白是唯一已知的可以靶向乙酰化赖氨酸残基的蛋白质模块。在骨肉瘤的治疗过程中,骨肉瘤容易出现化疗药物耐药情况,特别是在复发及转移的情况下,而细胞凋亡是骨肉瘤治疗过程产生耐药的重要分子基础。近些年的研究显示,溴结构域蛋白4与骨肉瘤抗凋亡存在着重要联系。因此,本研究旨在探索溴结构域蛋白4靶向抑制剂对骨肉瘤凋亡作用影响及相关分子机制。方法（1）在郑州大学第一附属医院选取12例2019-2021年病理诊断为骨肉瘤的样本,采用免疫组化的方法检测肿瘤组织与正常骨组织中BRD4的表达情况;（2）选用人源性骨肉瘤细胞株MNNG/HOS、Saos-2,采用小分子干扰RNA技术沉默BRD4在两种细胞系的表达,通过western blot和RT-qPCR方法检测凋亡相关因子在蛋白及mRNA水平上的变化;采用流式细胞仪检测骨肉瘤细胞凋亡情况;（3）使用不同浓度的溴结构域蛋白4靶向抑制剂ARV-825作用于MNNG/HOS和Saos-2细胞株不同时间,应用western blot法研究ARV-825对溴结构域蛋白4的降解作用;（4）使用不同浓度ARV-825作用于MNNG/HOS和Saos-2细胞株,应用western blot、RT-qPCR法检测凋亡相关因子及BCL-2凋亡蛋白家族Noxa等在蛋白及mRNA的表达情况;应用流式细胞技术检测药物作用后的细胞凋亡情况;（5）使用不同浓度ARV-825作用于MNNG/HOS和Saos-2细胞株,应用CCK-8法检测细胞活力,应用平板克隆方法检测细胞增殖。（6）使用siRNA沉默Noxa在Saos-2骨肉瘤细胞中的表达,ARV-825处理骨肉瘤细胞,western blot检测Noxa沉默情况,CCK-8方法检测骨肉瘤细胞增殖情况。结果（1）免疫组织化学方法显示,BRD4主要定位于细胞质中,BRD4在肿瘤组织中的表达量明显高于正常骨组织;（2）小分子干扰RNA沉默BRD4的表达后,western blot法结果显示,凋亡效应酶Caspase-9和Caspase-3的活化和PARP的裂解增加,Cyto-C从线粒体膜间隙释放到细胞浆含量中增加,促凋亡蛋白Noxa表达升高,抗凋亡蛋白BCL-XL表达下降;流式细胞技术显示,两种骨肉瘤细胞株凋亡增加;（3）应用ARV-825靶向降解BRD4后,western blot法结果显示,BRD4蛋白的降解依赖于ARV-825浓度诱导,并且这种降解作用长效且持久;（4）使用ARV-825抑制BRD4的表达后,ARV-825呈浓度依赖性诱导caspase-3,caspase-9的激活、PARP的裂解和Cyto-C向细胞质释放增加,Noxa在蛋白及mRNA水平表达升高,抗凋亡蛋白BCL-XL在蛋白及mRNA水平表达下降;流式细胞检测结果表明,ARV-825呈浓度依赖性诱导骨肉瘤细胞的凋亡;（5）CCK-8法结果显示,ARV-825能够强效抑制两种骨肉瘤细胞株的凋亡;平板克隆实验结果显示,ARV-825能显著抑制骨肉瘤细胞株的长期增殖。（6）siRNA沉默Noxa表达后,CCK-8法显示ARV-825对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用减弱。结论（1）BRD4的高表达是造成骨肉瘤细胞对凋亡抵抗的重要分子机制之一;（2）ARV-825能够通过快速、高效增加细胞凋亡、长效抑制细胞增殖而抑制骨肉瘤细胞的生长;（3）利用PROTAC分子ARV-825靶向降解BRD4蛋白,并通过促进骨肉瘤凋亡在临床治疗骨肉瘤方面具有潜在治疗意义;（4）BRD4通过抑制Noxa对骨肉瘤细胞发挥抗凋亡作用。
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