【摘 要】
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背景股骨头坏死是由多种原因引起股骨头血供破坏,最终导致股骨头缺血坏死及塌陷的病理过程。目前激素性股骨头缺血坏死的发病机制还不明确,随着分子与细胞生物学、干细胞等方面的研究不断深入,探讨激素作用于间充质干细胞以影响其成骨及成脂分化的研究逐年增加。激素具有诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的作用,导致脂质代谢异常,并引起成骨能力降低,过去已经在众多动物实验中得到证实,这种现象与人的激素导致的股骨头坏死
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背景股骨头坏死是由多种原因引起股骨头血供破坏,最终导致股骨头缺血坏死及塌陷的病理过程。目前激素性股骨头缺血坏死的发病机制还不明确,随着分子与细胞生物学、干细胞等方面的研究不断深入,探讨激素作用于间充质干细胞以影响其成骨及成脂分化的研究逐年增加。激素具有诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的作用,导致脂质代谢异常,并引起成骨能力降低,过去已经在众多动物实验中得到证实,这种现象与人的激素导致的股骨头坏死病理改变相似,但由于人和动物之间存在着种属特异性,以往研究多是从动物模型中取材体外培养,而直接从人体取材的研究相对较少。本研究从人体取材体外培养,通过测定Wnt信号通路中关键因子变化来证实成脂-成骨分化机制,并寻找其与目标miRNA相关联系,对于进一步研究人股骨头坏死的病理学机制具有重要意义。目的探讨激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化异常在股骨头坏死发生中的作用机制,通过检测其在经典Wnt/β-连环蛋白信号通路中关键因子的表达情况及miRNA高通量测序,研究人骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的机制。方法提取激素性股骨头坏死患者（观察组）和股骨颈骨折患者（对照组）的骨髓间充质干细胞。采用MTT法、细胞凋亡试验、活细胞和死细胞试验检测间充质干细胞增殖和凋亡的异常。成骨诱导和成脂诱导后分别进行茜素红和油红O染色,检测激素对骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化情况。通过Western blot及实时定量PCR检测经典Wnt/β-连环蛋白信号通路中关键因子的表达情况。使用GraphPad Prism（8.0.2）进行统计分析。应用高通量测序技术对miRNA进行差异表达分析和GO、KEGG富集分析。结果结果显示激素性股骨头坏死组（0.7±0.2）相比于对照组（1.0）BMSCs增殖能力显著性降低,p＜0.01。细胞凋亡检测示激素性股骨头坏死组（1.3±0.2）相比于对照组（1.0）骨髓间充质干细胞凋亡显著性升高,p＜0.05。活细胞试验,激素性股骨头坏死组（414.3±26.3）相比于对照组（600.0±79.3）骨髓间充质干细胞活细胞数减少,p＜0.05。死细胞试验激素性股骨头坏死组（139.3±23.0）相比于对照组（25.7±6.8）骨髓间充质干细胞死细胞数增多,p＜0.01。茜素红染色显示观察组红染区域面积减少。而油红O染色显示红染脂滴数量,观察组明显增多。Western blot检测PPARγ蛋白在激素性股骨头坏死中表达升高（1.35±0.23）;而RUNX2（0.58±0.11）、Wnt5a/b（0.69±0.22）、β-catenin（0.66±0.11）蛋白表达降低。实时定量 PCR 检测 BMP2（0.73+0.16）、RUNX2（0.57+0.17）、Collagen I mRNA（0.48+0.26）表达降低;而PPARG mRNA（1.48+0.32）表达升高。差异均有统计学意义。高通量测序结果显示已知差异表达的miRNA有63个,其中52个上调,11个下调。KEGG富集分析结果显示差异miRNA主要参与调节Wnt signaling pathway、Hippo signaling pathway、Calcium signaling pathway 三条激素性股骨头坏死疾病重要通路。表明miRNA在SONFH发病过程的多个环节和通路中发挥作用。结论1.激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞增殖能力下降,其经典Wnt/β-连环蛋白信号通路受到抑制,BMSCs成骨分化能力减弱,而成脂分化能力增强,继而导致成骨成脂分化平衡紊乱。2.富集分析表明 Wnt signaling pathway、Hippo signaling pathway、Calcium signaling pathway是激素性股骨头坏死疾病最重要的三条通路,尤其是Wnt信号通路对研究人的激素性股骨头坏死具有重要意义。
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