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木豆（Cajanus cajan（L.）Millsp）是世界上第五大豆类作物,主要种植在亚热带和热带地区。木豆中的主要次生代谢活性产物是酚类化合物。由于木豆中存在多种有益健康的营养物质和药理活性物质,可作为食品、饲料、营养品和医药工业的原料等多方面用途而受到高度关注。然而大田栽培木豆存在受季节、品种、气候和地理等因素的影响而导致的酚类化合物含量波动,直接影响了木豆提取物在营养/医药行业中的应用。植物组织培养技术因其不受地理、气候等因素影响且能稳定生产植物次生代谢活性成分等诸多突出的优点而被认为是最有前途的替代方法之一。其中,毛状根培养技术具有安全可靠、遗传稳定、生长快速、次生代谢产物合成能力高、易保存和规模化生产等优点,现己成为高效生产药用植物次生代谢活性成分及研究其生物合成调控机制的理想生物系统。基于以上所述,本项研究首先拟建立能够精确追踪和痕量分析木豆毛状根中主要酚类活性成分的UPLC-Qq Q-MS/MS分析方法;其次,拟建立一个稳定高产酚类活性成分的木豆毛状根培养体系,用以作为生产酚类活性成分以及研究其相关生物合成调控机制的模式平台;最后,利用UV-B诱导木豆毛状根培养体系,并以目标次生代谢活性成分积累量为指标,优化并确定UV-B诱导增量的最佳条件,结合q RT-PCR分析UV-B诱导木豆毛状根过程中酚类活性成分生物合成候选酶基因的表达差异性规律,以期初步明确UV-B诱导木豆毛状根中调控酚类活性成分生物合成的潜在关键酶基因。本论文的主要研究内容及结果如下:1、建立了检测木豆中主要酚类活性化合物的UPLC-MS/MS分析方法,条件如下:色谱条件:ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（50 mm×2.1 mm内径,1.8μm）;流动相体系为乙腈（A）和水（B）;梯度洗脱流程为0-2 min,25-35%A;2-3.5 min,35-90%A;3.5-5 min,90%A;5-5.1 min,90-25%A;5.1-6 min,25%A;柱温为30℃,流速为0.4 m L/min,进样量为1μL。质谱条件:球松素和木豆芪酸为电喷雾正离子电离模式,其余9种分析物在负电离模式下表现出较好的响应;最佳MRM条件下目标化合物离子对分别为荭草苷m/z447.1,327.0（ESI-）、异牡荆素m/z 431.1,341.0（ESI-）、牡荆素m/z 431.1,311.0（ESI-）、染料木苷m/z 431.1,268.1（ESI-）、木犀草素m/z 284.7,133.1（ESI-）、染料木素m/z 269.0,133.1（ESI-）、芹菜素m/z 269.0,117.1（ESI-）、异鼠李素m/z 315.1,300.0（ESI-）、鹰嘴豆芽素A m/z 283.1,268.1（ESI-）、球松素m/z 271.1,167.1（ESI+）、木豆芪酸m/z 339.0,283.2（ESI+）。利用上述UPLC-Qq Q-MS/MS检测方法,在极短的运行时间（6 min）内,既能够有效摒弃其他非目标杂质成分的干扰,也可同时定量测定木豆毛状根中11种生物活性酚类化合物,适用于对后续木豆毛状根中痕量级酚类活性成分的分析检测。2、优化并建立了高产酚类活性成分的木豆毛状根培养体系（1）选取2周龄的木豆叶外植体与发根农杆菌LBA9402在含有75μM乙酰丁香酮和400 mg/L头孢噻肟钠的培养基中共培养2天,可使木豆毛状根在10天的诱导周期内诱导率达到70.92±8.14%;同时以木豆毛状根生物量和酚类活性成分积累量为考察指标,从12株候选毛状根株系中成功筛选出高产酚类化合物的毛状根株系PPHRL II,并进行了相关分子生物学鉴定。（2）对木豆毛状根株系PPHRL II的液体培养条件和接种量进行了系统优化,得到的最佳培养条件如下:1/2 MS液体培养基、初始p H值5.8、蔗糖浓度3.0%、接种量2.0%、温度27℃和生长周期42天。在该培养条件下,木豆毛状根培养体系中收获的最佳生物量为6.95±0.68 g/L和总酚得率为3278.44±226.25μg/g DW。3、研究了UV-B辐射对木豆毛状根培养体系中酚类化合物的诱导增量和代谢调控（1）确定了UV-B诱导42日龄木豆毛状根培养体系中黄酮类化合物的最佳诱导时间为4 h,此条件下其产率为414.95±50.68μg/g DW,比对照组（278.49±28.36μg/g DW）高1.49倍;木豆芪酸的最佳诱导时间为10 h,此条件下其产率为6566.01±702.14μg/g DW,比对照组（2842.43±162.57μg/g DW）高2.31倍。（2）通过测定UV-B诱导前后木豆毛状根培养体系中三种氧化产物的含量以及三种抗氧化酶活性,确定了木豆毛状根对UV-B诱导表现出显著的氧化应激防御响应。（3）通过SEM观察UV-B诱导前后木豆毛状根组织的表型,发现UV-B辐射42日龄的木豆毛状根组织受到了严重的损伤。此外,通过UPLC-Qq Q-MS/MS分析方法对UV-B处理前后的木豆毛状根中水杨酸的含量进行检测,发现除24 h外其他时间点木豆毛状根中水杨酸的含量均显著高于对照组（9.93±2.71 ng/g FW）,证实UV-B辐射可以触发伤害/防御信号通路。（4）利用q RT-PCR对相关黄酮类化合物生物合成酶基因转录表达分析结果表明CHS、IOMT、I3’H和IFR是与UV-B诱导调控木豆毛状根中总黄酮生物合成密切相关的基因;对相关木豆芪酸生物合成酶基因转录表达分析结果表明PAL2、4CL1、4CL2和STS1是与UV-B诱导调控木豆毛状根中木豆芪酸生物合成密切相关的基因。综上所述,本研究成功建立了一个精确追踪和痕量分析11种酚类活性成分的UPLC-Qq Q-MS/MS分析方法;成功建立了一个高产酚类活性成分的木豆毛状根培养体系,为利用木豆毛状根培养技术规模化生产酚类化合物提供了理论基础;利用UV-B辐射在增强了木豆毛状根中酚类活性成分产率的同时,也初步明确UV-B调控木豆毛状根中酚类生物合成的内在机制,为将来利用代谢工程技术手段高产酚类化合物提供理论依据。