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[目 的]探究卵巢普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌中KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变情况与临床病理特征、雌/孕激素表达水平之间的关系。利用高通量测序技术对相关卵巢低级别浆液性肿瘤以及配对正常卵巢组织的mRNA进行测序,筛选出差异表达mRNA,并利用生物信息学技术分析差异表达mRNA;实时定量PCR及免疫组织化学技术分别从基因和蛋白水平上验证差异mRNA,揭示卵巢低级别浆液性肿瘤发生发展过程中显著差异表达基因,为深入认识卵巢浆液性肿瘤发生的分子机制打下基础。[方法]1.检索既往接受手术治疗的普通型浆液性交界性肿瘤(53例)、微乳头型浆液性交界性肿瘤(36例)和低级别浆液性癌(17例)患者资料,进行回顾性临床病理特征分析。2.利用扩增阻碍突变系统(amplification refractorymutation system,ARMS)和实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测普通型浆液性交界性肿瘤(23例)、微乳头型浆液性交界性肿瘤(27例)和低级别浆液性癌(14例)石蜡组织中KRAS、NRAS、PIK3CA以及BRAF基因突变情况;同时利用免疫组织化学法检测肿瘤组织中雌/孕激素表达状态,分析其与临床病理特征、基因突变类型之间的关系。3.卵巢低级别浆液性肿瘤差异表达mRNA检测。分别对普通型浆液性交界性肿瘤和配对正常卵巢组织(4对)、微乳头型浆液性交界性肿瘤和配对正常卵巢组织(4对)、低级别浆液性癌和配对正常卵巢组织(4对)进行转录组测序,通过计算mRNA表达量筛选出差异表达mRNA,构建卵巢低级别浆液性肿瘤中mRNA差异表达谱。4.利用生物信息学技术分析差异表达mRNA。对差异表达的mRNA进行Gene Ontology富集分析、KEGG Pathway富集分析,揭示差异表达mRNA可能存在的差异功能以及主要参与的信号通路;结合分析结果,筛选与增殖、迁移相关的关键差异表达mRNA。5.差异表达基因验证。扩大样本量,选取普通型浆液性交界性肿瘤和配对正常卵巢组织(9对)、微乳头型浆液性交界性肿瘤和配对正常卵巢组织(7对)、低级别浆液性癌和配对正常卵巢组织(5对),利用RT-qPCR技术对与增殖、侵袭相关的差异表达的mRNA在基因水平进行验证。进一步扩大样本量,选取10例正常卵巢上皮组织、26例普通型浆液性交界性肿瘤、33例微乳头型浆液性交界性肿瘤、15例低级别浆液性癌,利用免疫组织化学技术在基因蛋白水平验证,并分析显著差异表达的基因与患者临床病理参数之间相关性,以期为卵巢低级别浆液性肿瘤发生的分子机制研究打下基础。[结 果]1.普通型浆液性交界性肿瘤常见于35岁以下、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者,较少发生微浸润(p<0.05);微乳头型浆液性交界性肿瘤患者易发生微浸润(p<0.05),其他不同临床病理特征间均无统计学意义(p>0.05);低级别浆液性癌常见于在35岁以上、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期,淋巴结常受累(p<0.05)。2.基于ARMS和RT-qPCR技术,64例肿瘤组织中共检测出36例突变,其中KRAS突变21例、BRAF突变12例、PIK3CA突变2例和NRAS突变1例,且各基因突变之间无重叠。KRAS、BRAF突变常见于35岁以下年轻女性。在KRAS突变亚型中,G12S、G12D突变常见于微乳头型浆液性交界性肿瘤(p<0.05);G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*突变常见于普通型浆液性交界性肿瘤(p<0.05);G13D突变仅在低级别浆液性癌中检出。携带BRAF突变的患者均见于疾病早期阶段(Ⅰ~Ⅱ期)。基于免疫组织化学技术,雌激素表达和孕激素表达率均为76.6%(49/64)。普通型浆液性交界性肿瘤和微乳头型浆液性交界性肿瘤之间的雌/孕激素的阳性表达率相似,但均显著高于低级别浆液性癌(p<0.05)。雌/孕激素高表达常见于35岁以下、TNM分期I~Ⅱ期患者(p<0.05),与各基因突变之间无统计学差异。3.利用转录组测序分析,在基因定量分析中筛选出15886个基因。差异表达基因中,与配对正常卵巢组织相比,普通型浆液性交界性肿瘤中筛选出866个基因上调,363个基因下调;微乳头型浆液性交界性肿瘤中筛选出426个基因上调,519个基因下调;低级别浆液性癌中共筛出687个基因上调,231个基因下调。在上调基因中,普通型浆液性交界性肿瘤和微乳头型浆液性交界性肿瘤有122个共存基因,微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌有48个共存基因,普通型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌有125个共存基因,普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌有25个共存基因;在下调基因中,普通型浆液性交界性肿瘤和微乳头型浆液性交界性肿瘤有127个共存基因,微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌有30个共存基因,普通型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌有23个共存基因,普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌有10个共存基因。4.差异表达mRNA富集分析发现,在普通型浆液性交界性肿瘤中,上调mRNA参与1029个生物学过程、187个细胞组成、182个分子功能和11个KEGG信号通路条目,下调mRNA参与1345个生物学过程、167个细胞组成、166个分子功能和33个KEGG信号通路条目;在微乳头型浆液性交界性肿瘤中,上调mRNA参与774个生物学过程、100个细胞组成、91个分子功能和10个KEGG信号通路,下调mRNA参与1806个生物学过程、203个细胞组成、246个分子功能和46个KEGG信号通路;在低级别浆液性癌中,上调mRNA参与851个生物学过程、162个细胞组成、155个分子功能和11个KEGG信号通路,下调mRNA参与1017个生物学过程、122个细胞组成、115个分子功能和22个KEGG信号通路。5.在显著差异基因中,基于Gene Ontology富集分析筛选出与增殖、迁移有关的10个上调基因和34个下调基因,分别选取前3个差异最显著的上调基因(FOXJ1、ITGB8、LAMA5)和下调基因(PRRX1、SNAI2、IGFBP6)进行验证。扩大样本量并利用RT-qPCR技术验证基因表达量发现,相比正常卵巢组织,FOXJ1基因在普通型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌中显著上调,有统计学意义(p=0.016、0.037),微乳头型浆液性交界性肿瘤中上调不显著(p=0.311)。ITGB8基因在普通型浆液性交界性肿瘤和微乳头型浆液性交界性肿瘤中显著上调,有统计学意义(p=0.013、0.03),在低级别浆液性癌中上调不显著(p=0.109)。LAMA5基因在普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌中上调均不显著,无统计学意义(p=0.159、0.192、0.068)。PRRX1基因在普通型浆液性交界性肿瘤和微乳头型浆液性交界性肿瘤中显著下调,有统计学意义(p=0.027、0.049),在低级别浆液性癌中下调不显著(p=0.217)。SNAI2基因在普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌中下调均不显著,无统计学意义(p=0.116、0.149、0.375)。IGFBP6基因在微乳头型浆液性交界性肿瘤中显著下调,有统计学意义(p=0.036),在普通型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌中下调不显著(p=0.16、0.137)。RT-qPCR验证结果与mRNA测序结果基本一致。6.针对RT-qPCR差异基因验证结果,检测FOXJ1和ITGB8的相对定量表达表达差异最显著。进一步扩大样本量,利用免疫组化学技术验证发现,FOXJ1基因在正常卵巢上皮组织中不表达,在普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤、低级别浆液性癌中阳性表达率分别为80.8%、75.8%、13.3%。分析基因蛋白表达与临床病理特征关系,发现FOXJ1高表达常见于35岁以下,疾病早期阶段。ITGB8基因在正常卵巢上皮组织中不表达,在普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤、低级别浆液性癌中阳性表达率分别为61.5%、66.7%、53.3%。ITGB8与各临床病理特征之间无统计学差异。[结 论]1.普通型浆液性交界性肿瘤患者多发生于35岁以下年轻育龄女性,处于疾病早期阶段(Ⅰ~Ⅱ期)。微乳头型浆液性交界性肿瘤常出现微浸润。2.KRAS突变可能是卵巢低级别浆液性肿瘤的致癌驱动因子。BRAF突变可能对疾病的进展有保护作用。PIK3CA、NRAS突变率较低。3.雌/孕激素表达在普通型浆液性交界性肿瘤和微乳头型浆液性肿瘤中显著高于低级别浆液性癌,且更常见于35岁以下育龄女性,处于疾病早期阶段(Ⅰ~Ⅱ期)。激素表达和基因突变之间无显著相关性。4.mRNA测序分析,与配对正常卵巢组织相比,普通型浆液性交界性肿瘤中共筛选出866个基因上调,363个基因下调;微乳头型浆液性交界性肿瘤中共筛选出426个基因上调,519个基因下调;低级别浆液性癌中共筛选出687个基因上调,231个基因下调。卵巢低级别浆液性肿瘤中,不同病变间存在较多差异基因提示疾病发生发展的多样性。5.基于RT-qPCR技术验证,FOXJ1基因在普通型浆液性交界性肿瘤、低级别浆液性癌中上调。ITGB8基因在普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤中显著上调。LAMA5基因在卵巢低级别浆液性肿瘤中上调均不显著。PRRX1基因在普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤中显著下调。IGFBP6基因在微乳头型浆液性交界性肿瘤中显著下调。SNAI2基因在卵巢低级别浆液性性肿瘤中下调均不显著。6.基于免疫组织化学技术验证,FOXJ1和ITGB8基因在正常卵巢上皮组织中不表达,在普通型浆液性交界性肿瘤、微乳头型浆液性交界性肿瘤和低级别浆液性癌中高表达。FOXJ1表达与肿瘤低分化、患者年龄和临床分期相关。