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[目的]探究曲札茋苷发挥脑保护作用与自噬调控的关系,旨在研究其可能的机制,为曲札茋苷的临床推广应用提供参考。[方法]1.动物实验:曲札茋苷对缺血性脑卒中的保护作用与自噬的相关性(1)建立小鼠p-MCAO模型,实验分为:假手术组、p-MCAO模型组、曲札茋苷组(5、10mg/kg)、依达拉奉组(10mg/kg)。造模缺血2h给药,连续观察10天,每天给药1次,观察曲札茋苷对永久缺血小鼠的死亡率及存活时间的影响。(2)建立小鼠t-MCAO模型,实验分为:假手术组、t-MCAO模型组、曲札茋苷组(5、10mg/kg)、依达拉奉组(10mg/kg)。除假手术组外,其他各组均复制t-MCAO模型。缺血2h给药再灌注24h后,采用Longa评分法评价小鼠神经行为学功能,TTC染色法评价脑梗死体积,HE染色观察脑组织神经元病理改变,ELISA 检测血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD 与 MDA 的含量;Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ与P62的表达及自噬信号通路PI3K-AKT-mTOR蛋白及其磷酸化水平的表达;采用Real-time PCR检测P62、PI3K、AKT与mTOR mRNA的表达情况。2.细胞实验:曲札茋苷对OGD/R损伤PC12细胞的保护作用及对自噬的影响(1)建立PC12细胞OGD/R损伤模型,实验分为五组:Control组、OGD/R组、曲札茋苷(0.62、1.85、5.56、16.67、50μM)组,各组缺糖缺氧处理4h,复糖复氧1h后,CTG化学发光法检测细胞活力,荧光探针法检测活性氧(ROS)荧光强度,流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ与P62的表达水平,以及自噬信号通路PI3K-AKT-mTOR蛋白及其磷酸化水平。(2)证实曲札茋苷通过抑制自噬对OGD/R损伤的PC 12细胞产生保护作用。将PC12细胞分为:Control组、OGD/R组、OGD/R+曲札茋苷(0.5μM)组、OGD/R+3-MA(5μM)组、OGD/R+3-MA(5μM)+曲札茋苷(0.5μM)组。给予自噬抑制剂3-MA(5μM)预处理24h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62,与信号通路PI3K-AKT-mTOR蛋白及其磷酸化水平的表达。[结果]1.p-MCAO模型实验结果显示:与p-MCAO组比,曲札茋苷(5mg/kg)组小鼠72h死亡率明显降低(P<0.05),曲札茋苷(5、10mg/kg)组小鼠生存时间均延长(P<0.01);依达拉奉(10mg/kg)组小鼠存活时间延长(P<0.05)。2.t-MCAO模型实验结果显示:(1)与假手术组比,t-MCAO组小鼠的神经行为学评分升高,脑系数及脑梗死体积增加;HE染色结果显示,模型组梗死侧皮质区神经元排列紊乱,细胞间隙变宽、皱缩形成空泡,大量神经元胞核异型且染色质深染。与t-MCAO组比较,曲札茋苷(5、10mg/kg)组小鼠神经行为学评分降低(P<0.05),脑系数降低(P<0.05),脑梗死体积显著减少(P<0.01),神经元病理损伤得到改善。(2)与假手术组比,t-MCAO组小鼠血清的MDA、TNF-α、IL-1β与IL-6含量增加(P<0.01),SOD活性下降(P<0.01)。与t-MCAO组比,曲札茋苷(5、10mg/kg)组 SOD 活性增强,TNF-α、IL-1β与 IL-6 含量降低(P<0.05)。(3)Western Blot结果显示:与假手术组比,t-MCAO组自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ 表达增加(P<0.05);P62、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 表达降低(P<0.01)。与 t-MCAO 组比,曲札茋苷(10mg/kg)组 Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ 表达显著降低(P<0.01),P62、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 表达显著增加(P<0.01)。Real-time PCR 结果显示:与假手术组比,t-MCAO 组的 P62、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达表达明显降低(P<0.01)。与t-MCAO组比,曲札茋苷(5mg/kg)组 P62、PI3K、AKT、mTOR mRNA 表达增加(P<0.05)。3.与正常对照组比较,缺糖缺氧4h,复糖复氧1h,细胞存活率显著下降(P<0.01),ROS含量及细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。与OGD/R组相比,曲札茋苷(0.62、1.85、5.56μM)组细胞存活率显著升高(P<0.01),曲札茋苷(0.5、5μM)组的ROS含量及细胞凋亡率显著减少(P<0.01)。Western Blot结果显示:与正常对照组比较,OGD/R 组的 Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ 表达明显增加(P<0.01);P62、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达降低(P<0.05)。与OGD/R组比较,曲札茋苷组(5μM)组 Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ 表达显著降低(P<0.01),P62、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达显著增加(P<0.05)。4.3-MA预处理后,与曲札茋苷、3-MA单用组比,曲札茋苷(0.5μM)联用3-MA(5μM)组细胞凋亡率显著降低(P<0.01),LC3-Ⅱ/Ⅰ表达降低(P<0.05),p-PI3K、p-AKT 表达增加(P<0.05)。[结论]1.曲札茋苷能有效延长p-MCAO小鼠的生存时间,降低t-MCAO模型小鼠的神经行为学评分、减小脑梗死体积,抑制脑水肿,减轻神经元损伤;增加OGD/R损伤PC12细胞的活力,减少ROS含量及细胞凋亡。2.曲札茋苷通过下调自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平,上调P62、蛋白及mRNA的表达水平而抑制自噬。自噬抑制剂3-MA预处理后曲札茋苷抑制自噬的作用增强。3.曲札茋苷抑制自噬发挥神经保护作用,其机制可能与上调PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。