【摘 要】
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高效分离纯化重组酶蛋白是实验室开展酶学研究的基础,同时也是酶制剂工业化生产的重要环节。目前获得高纯度重组酶蛋白的主要方法是亲和层析,即将目的蛋白与纯化标签通过基因工程技术进行融合表达,利用纯化标签与层析介质上配体间的特异性相互作用进行吸附与洗脱。然而利用亲和层析法纯化重组酶蛋白存在诸多局限,如色谱填料成本高、一些标签难以获得高纯度蛋白、标签序列影响酶蛋白的功能活性需要用蛋白酶切除从而增加生产成本等
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高效分离纯化重组酶蛋白是实验室开展酶学研究的基础,同时也是酶制剂工业化生产的重要环节。目前获得高纯度重组酶蛋白的主要方法是亲和层析,即将目的蛋白与纯化标签通过基因工程技术进行融合表达,利用纯化标签与层析介质上配体间的特异性相互作用进行吸附与洗脱。然而利用亲和层析法纯化重组酶蛋白存在诸多局限,如色谱填料成本高、一些标签难以获得高纯度蛋白、标签序列影响酶蛋白的功能活性需要用蛋白酶切除从而增加生产成本等。针对上述问题,本论文提出集成抗冻蛋白AFP（Antifreeze protein,AFP）的特异性冰结合特性和内含肽的可控自切割特性,构建新型抗冻蛋白-内含肽纯化标签,利用模式蛋白考察其用于重组酶蛋白高效分离纯化的可行性,从而为酶工程领域提供一种低成本、操作简单、易切除标签序列的酶分离纯化方法。本论文提出将源于南极鱼Lycodichthyus dearborni的AFP基因和两种改造后分别具有N/C端可控自切割活性的Mxe Gyr A和Ssp Dna B内含肽基因进行融合,构建新型抗冻蛋白-内含肽纯化标签,利用模式蛋白谷胱甘肽巯基转移酶（Gultathione S-transferase,GST）考察其用于重组酶蛋白分离纯化的效果。首先分别利用RF克隆（Restriction free-cloning）技术和酶切连接技术构建p ET 28a-AFP-GSlinker-Ssp Dna B-GST和p ET24a-GST-Mxe Gyr A-PTlinker-AFP表达载体,分别转化至大肠杆菌表达宿主E.coli BL21（DE3）,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）进行诱导表达。利用冰作为吸附剂将细胞破碎上清液中的目的蛋白AFP-GSlinker-Ssp Dna B-GST和GST-Mxe Gyr A-PTlinker-AFP进行一步分离纯化,之后将冰融化并在温和的反应条件下分别使Ssp Dna B标签的C端发生断裂反应、使Mxe Gyr A标签的N端发生断裂反应从而使纯化标签与目的蛋白分离,最后再次利用冰吸附去除纯化标签从而得到GST纯酶,检测其纯度和活性,在上述研究过程中进行冰亲和吸附动力学研究和内含肽断裂反应条件优化。本课题的成功实施有望将新型抗冻蛋白-内含肽纯化标签扩充到酶工程领域中,为工业酶制剂的分离纯化提供新方法。
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