甾体化合物,广泛存在于自然界中,在医药等领域具有重要的价值,甾体类药物是仅次于抗生素的第二大类药物。17β-羟基甾体化合物不仅本身具有重要的药用价值,也是合成多种甾体药物的重要中间体。17-羰基的选择性还原是合成17β-羟基甾体化合物的最直接的方法,但由于分子中通常含有多个羰基,化学还原存在区域选择性和立体选择性低的问题,而羰基还原酶具有高的区域选择性和立体选择性,且反应条件更温和,为获得17β-羟基甾体化合物提供了一种直接有效的方法。本课题以雄烯二酮（AD）为底物,通过对实验室保存的羰基还原酶进行筛选,发现来源于Ralstonia sp.DSM6428的醇脱氢酶Ras ADH和它的突变体Ras ADH F205A能够高效催化雄烯二酮（AD）转化生成睾酮（TS）,并且突变体Ras ADH F205A的活性远高于野生型。由于205位点对酶活影响比较大,因此将野生型Ras ADH的205位点定点突变成其余18种氨基酸,以AD为底物,研究了这些突变体的酶活和立体选择性,发现最优突变体Ras ADH F205I的催化活性相较于野生型Ras ADH提高了3.2倍,并保持了其立体选择性。有趣的是,相较于野生型酶,突变体Ras ADH F205I对多种17位羰基甾体化合物的催化效率提高了6-623倍,同时保持同样高的立体选择性。以AD为底物对反应条件进行优化,确定了突变体F205I催化反应的最优条件为p H 7.0,助溶剂为5%（v/v）的甲醇。在优化后的条件下,利用突变体Ras ADH F205I制备了一系列不同的17β-羟基甾体化合物,在6 h内最高转化底物浓度达到30 g/L,反应转化率＞90%,分离产率在72%-96%之间,非对映值（diastereomeric excess,de）＞99%,对底物AD的时空产率达到39.7 g/（L·d）,远高于文献报道水平。通过分子对接,从分子水平解释突变体Ras ADH F205I活性提高的原因。代表性底物的酶-底物分子对接结果表明,在突变体酶中来自NADPH的C4-H和底物羰基的C17之间的距离由3.8?缩短至3.0?。F205突变为更小的氨基酸可能增加了位于底物结合口袋入口处的?6-螺旋的柔性,为底物的结合提供了额外的空间,从而提高了酶的活性,并保留了其立体选择性。综上所述,Ras ADH F205I是一种催化合成17β-羟基甾体化合物的优良催化剂。