羟基四氢嘧啶是一种优良的相容性溶质,具有良好的渗透保护和细胞保护等功能。目前,羟基四氢嘧啶的合成途径中存在多基因表达不匹配、产物合成与细胞生长不协调等问题,导致产物中容易积累副产物四氢嘧啶,难以实现单一产物羟基四氢嘧啶的高效合成。本研究通过对嗜盐菌Halomonas elongata来源的四氢嘧啶合成模块与羟基四氢嘧啶合成模块基因的启动子类型、拷贝数等进行组合优化,对异源合成途径的多基因表达进行了协调优化;并利用细胞群体效应动态调控共同底物α-酮戊二酸的供应,构建了不需要盐激诱导高效合成单一产物羟基四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌。首先,通过优化不同基因启动子强度、拷贝数,平衡多酶表达强度,减少副产物四氢嘧啶的积累。对四氢嘧啶合成过程的关键酶基因ect ABC与lys Ccgl进行了Ptrc和PT7启动子控制下的不同拷贝数优化,构建不同启动子控制的四氢嘧啶合成模块,并分别与不同拷贝数PT7启动子控制的羟化模块进行组合,构建羟基四氢嘧啶合成通路。初步获得了一株高产羟基四氢嘧啶且副产物四氢嘧啶积累量很少的大肠杆菌工程菌HECT12,摇瓶发酵36 h羟基四氢嘧啶的产量达到12.12 g/L,四氢嘧啶积累量为0.24g/L。其次,采用不同策略调控羟基四氢嘧啶合成的共底物α-酮戊二酸供应,对产物合成与细胞生长代谢进行平衡。通过培养基添加的方式,在发酵0 h添加50 m Mα-酮戊二酸可实现菌株HECT12中羟基四氢嘧啶的单一生产。进一步尝试强化α-酮戊二酸的胞内供应,以代替额外添加。通过过表达异柠檬酸脱氢酶编码基因icd,增强了α-酮戊二酸的合成。分别对细胞内α-酮戊二酸在TCA循环代谢中的关键基因suc A进行了弱启动子替换的静态调控与基于细胞群体感应系统的动态调控。相比较而言,动态调控能够更好地进行细胞生长与产物合成的平衡。最终获得的工程菌HECT31,在无盐诱导、不添加α-酮戊二酸的发酵条件下,实现了羟基四氢嘧啶的高效合成,摇瓶发酵发酵36 h羟基四氢嘧啶产量达到14.93 g/L,是目前分批发酵生产羟基四氢嘧啶的最高水平,且无副产物四氢嘧啶的积累,具有重要的工业应用价值。