【摘 要】
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磷脂酶B（PLB）能够特异性水解磷脂的sn-1和sn-2位酯键,可应用于水解磷脂酰胆碱（PC）合成甘油磷脂酰胆碱（L-alpha-glycerylphosphorylcholine,GPC）。GPC可以为乙酰胆碱的合成提供胆碱,除此之外,GPC还具有治疗脑部疾病、合成生长激素等生理功能,被广泛应用于食品、医药和化妆品行业。天然GPC的含量较少,难以通过提取获得。由于底物和催化剂具有毒性,化学合成法
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磷脂酶B（PLB）能够特异性水解磷脂的sn-1和sn-2位酯键,可应用于水解磷脂酰胆碱（PC）合成甘油磷脂酰胆碱（L-alpha-glycerylphosphorylcholine,GPC）。GPC可以为乙酰胆碱的合成提供胆碱,除此之外,GPC还具有治疗脑部疾病、合成生长激素等生理功能,被广泛应用于食品、医药和化妆品行业。天然GPC的含量较少,难以通过提取获得。由于底物和催化剂具有毒性,化学合成法制备GPC无法应用于食品行业。利用PLB合成GPC具备反应条件温和、绿色无污染等优点。本研究的主要内容及结果如下:（1）从富油土壤中筛选产磷脂酶的菌株,提取菌株基因组,扩增所筛选菌株的16s r DNA,通过构建系统发育树鉴定菌株为贝莱斯芽孢杆菌,并命名为Bacillus velezensis TCCC 111904。（2）扩增B.velezensis TCCC 111904的PLB基因（plb）,与毕赤酵母游离表达载体p PIC9K和表面展示p KFS表达载体连接,经测序分析,plb基因片段长度为783 bp,编码261个氨基酸。（3）实现plb在毕赤酵母中游离表达及纯化,对纯化后的游离磷脂酶B（fPLB）进行功能分析,确定fPLB可特异性水解磷脂的sn-1和sn-2位酯键。（4）对fPLB进行酶学性质研究,结果表明:fPLB的最适温度为20℃、最适pH值为8.0;fPLB在50℃以下,pH 6.0-9.0范围内稳定,1 m M的Zn2+对酶活力有提升作用。（5）实现PLB在毕赤酵母上表面展示,对展示磷脂酶B（dPLB）进行酶学性质研究,结果表明:dPLB的最适温度为20℃、最适pH值为8.0;dPLB在60℃以下,pH 5.0-10.0范围内稳定,稳定性得到提升。（6）对dPLB合成GPC的条件进行优化,经过试验确定dPLB最适催化条件为:底物添加量0.1 g、反应温度20℃、pH 8.0、酶添加量400 U、催化时间3 h,GPC的产率达到92.7%;全细胞催化剂至少可以循环使用7次。
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