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背景急性胸主动脉夹层（Acute thoracic aortic dissection,ATAD）是急性胸痛三联征中最危险的一种,临床表现复杂,诊断困难,手术风险极大,是死亡率极高的主动脉急性疾病。其发病过程为主动脉内高压血液从内膜破口冲入主动脉中层,造成中层的顺行和/或逆行撕裂,形成真假两腔。假腔内血液积聚,假腔外层菲薄,合并患者疼痛不适造成血压骤升,最终可因外膜破裂导致急性心包填塞、失血性休克等导致病人短时间内死亡。若不给予积极干预,在最初的48小时内,每小时的死亡率大约1%。大多数ATAD患者为散发性,而其具体发病机制尚未阐明,缺乏有效的药物治疗,尤其是预防类的药物。故而,在研究ATAD发病机制的基础上开发预防治疗措施,有助于降低发病率和死亡率。正常成人主动脉中层由40-70层弹性膜组成,富含弹力纤维,是主动脉的主要功能结构。ATAD发生的重要病理基础是细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）中弹力纤维断裂,大量弹力蛋白丢失,弹性膜机械结构遭到破坏,失去完整性,机械性能下降。基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2,MMP-2）过度活化后可以促进ECM的过度降解,是ECM降解破坏的重要机制。MMP-2主要由血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）分泌,前体MMP-2没有活性,被激活后变成活化的MMP-2方可发挥降解ECM作用。但主动脉中层VSMCs同时分泌特异性的MMP-2抑制剂,即组织基质金属蛋白酶抑制因子-2（Tissue inhibitors of metalloproteinase-2,TIMP-2）。目前研究发现TIMP-2/MMP-2失衡在多种疾病中发挥作用。NANOG是一种转录因子,能够维持胚胎干细胞的自我更新的能力与全能性。在未分化的胚胎干细胞中NANOG表达很高,在其分化过程中表达下调,伴随多能性丢失,在分化成熟的体细胞内NANOG的表达极低。相反,在成熟分化的细胞中过表达NANOG后,细胞向去分化转化,增殖功能增强,可以与OCT4、SOX2、LIN28共同作用将人类体细胞重新编程为具有胚胎干细胞基本特征的多能干细胞。NANOG可以促进VSMCs向分泌型转化,同时伴有MMP-2的活化增加,但具体机制目前仍旧不清楚。Micro RNA（mi R）是转录后调节因子,是表观遗传机制调节的重要因子,调控细胞增殖、分化和存活等基本生物过程。通常,mi R是与既定基因m RNA互补的RNA序列,引导该m RNA的沉默或降解,行使转录后调控的作用。TIMP-2的m RNA的3’端非编码区存在mi R-17-92基因簇中多个mi R的种子序列结合区,而在mi R-17-92基因簇的启动子区域存在NANOG的结合位点。然而,目前关于NANOG是否可通过mi R-17-92基因簇调控TIMP-2仍旧没有相关文献报道。本实验研究的目的是采用组织学与分子生物学的方法探索NANOG通过调控mi R-20a,抑制TIMP-2的表达,导致TIMP-2/MMP-2失衡,促进MMP-2的活化,产生ECM的过度降解而参与ATAD发生中的作用与机制。方法:（一）主动脉组织标本的收集、检测主动脉标本:正常主动脉组织来源于心脏移植供、受体,或主动脉瓣膜置换术患者,并排除相关血管病变,共10例。ATAD组人主动脉组织来源于Stanford A型急性主动脉夹层开放手术患者,共10例;每份收集的样本分组存放,分别用福尔马林或液氮保存,或立即用于VSMCs的分离与培养。然后组织切片后用于HE染色、Weigert弹力纤维染色、免疫组织化学染色;液氮冻存主动脉组织用于q RT-PCR、Western Blot等实验。（二）构建小鼠ATAD模型并检测采用β-氨基丙腈单富马酸酯饮水给药的方式喂养C57BL/6J小鼠4周,然后于皮下埋置血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）微量缓释泵,以1000ng/kg.min速度给药24h,构建小鼠ATAD模型。获取的组织样本分组保存。石蜡包埋组织切片后用于HE染色、Weigert弹力纤维染色、VB染色、免疫组织化学染色。超低温保存的样本用于q RT-PCR、Western Blot等实验。检测对照组和ATAD组小鼠主动脉组织中ECM降解、弹力蛋白丢失情况,NANOG、TIMP-2、活化MMP-2等m RNA与蛋白变化,在小鼠主动脉夹层模型中探索NANOG、TIMP-2、MMP-2以及ECM降解之间的关系。（三）NANOG转录调控mi R-20a调控作用及机制的研究1)贴壁法培养VSMCs:使用对照组主动脉组织标本进行原代VSMCs的分离与培养。新鲜标本去除内膜与外膜层,仅保留主动脉中层后剪成2×2mm大小组织块,接种于24孔细胞培养板,原代VSMCs迁移生长至融合约80%左右时传代。2)NANOG腺病毒转染:在VSMCs中通过腺病毒转染过表达NANOG,检测NANOG的m RNA和蛋白变化,在TIMP-2的m RNA水平和蛋白水平检测表达变化情况以及MMP-2活化情况,用Transwell检测细胞侵袭能力;3)转染NANOG的si RNA（Si-NANOG）:在VSMCs中转染NANOG的si RNA,然后分别在m RNA水平和蛋白水平检测NANOG的变化情况,在m RNA水平和蛋白水平检测的TIMP-2的表达变化情况以及MMP-2活化情况,用Transwell检测细胞侵袭能力;4)应用基因芯片检测、染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）、等检测NANOG调控mi R-20a后调节TIMP-2,人与小鼠ATAD中mi R-20a的变化趋势,以及NANOG与mi R-17-92基因簇启动子区域的结合位点。5)转染mi R-20a mimic/inhibitor,然后检测mi R-20a与TIMP-2的m RNA和蛋白表达变化情况,双萤光素酶报告分析研究mi R-20a/TIMP-2通路;6)通过q RT-PCR、Western blot等实验检测共转染Ad-NANONG/mi R-20a inhibitor,Si-NANOG/mi R-20a mimic,明确NANOG/mi R-20a/TIMP-2通路调节MMP-2的激活活化,并通过Transwell检测细胞侵袭能力。（四）统计分析组间比较采用t检验或卡方检验,根据小鼠的生存天数绘制Kaplan-Meier生存曲线。统计分析软件为SPSS 22.0与Prism 8.0,P＜0.05表示有统计学差异。结果:（一）ATAD主动脉组织中ECM过度降解,VSMCs中NANOG高表达,伴有TIMP-2表达下调与MMP-2过度活化HE染色、Weigert弹力纤维染色与Western blot检测提示ATAD主动脉组织ECM中弹力纤维断裂,过度降解,弹力蛋白含量下降。在ATAD组中,q RT-PCR提示NANOG表达增加,伴有TIMP-2的表达下降。在ATAD组中,Western blot与免疫组织化学检测结果提示:NANOG蛋白表达上调,TIMP-2的表达抑制,伴有MMP-2活化增加。（二）小鼠ATAD模型中NANOG高表达、TIMP-2表达抑制、MMP-2活化增加伴有ECM过度降解构建小鼠ATAD模型,从生存曲线、大体标本、心脏彩超检查、HE染色可见小鼠ATAD模型构建成功。Weigert弹力纤维染色、维多利亚蓝染色与Western blot检测显示ATAD组小鼠主动脉组织中弹力纤维断裂,弹力蛋白含量下降,ECM过度降解。在ATAD组小鼠中,q RT-PCR提示NANOG的m RNA表达增加,TIMP-2的m RNA表达下调。在ATAD组小鼠中,Western blot与免疫组织化学检测结果提示:NANOG蛋白表达上调,TIMP-2的表达抑制,伴有MMP-2活化增加。本部分的结果提示小鼠ATAD模型中,NANOG表达增加,伴有TIMP-2的抑制,MMP-2活化增加,从而促进ECM过度降解,参与小鼠ATAD的发生。（三）NANOG转录调控mi R-20a抑制TIMP-2表达,促进MMP-2活化1)正常来源主动脉组织采用贴壁法分离VSMCs,免疫荧光鉴定可见VSMCs呈长梭形,多数呈阳性染色,单个细胞中可见平行于长轴的细长肌丝。2)在正常VSMCs中过表达NANOG腺病毒,NANOG表达上调,TIMP-2的m RNA表达下调,抑制了TIMP-2的蛋白表达,导致MMP-2活化增加,细胞侵袭能力增加。3)在正常VSMCs中转染Si-NANOG,NANOG表达下调,TIMP-2表达增加,抑制了MMP-2活化,细胞侵袭能力下降。4)在正常VSMCs中转染Ad-NANOG过表达腺病毒,用芯片检测mi R-17-92基因簇显示mi R-20a表达上调。q RT-PCR检测人ATAD组主动脉组织显示mi R-20a表达上调,小鼠ATAD组模型中mi R-20a的表达也上调。Ch IP实验提示NANOG与mi R-17-92基因簇的启动子结合,上调mi R-20a的表达。5)在正常VSMCs中转染mi R-20a mimic后,TIMP-2的m RNA表达抑制,蛋白表达下降。转染mi R-20a inhibitor后,TIMP-2的m RNA表达上调,蛋白表达增加。双萤光素酶报告分析检测明确mi R-20a/TIMP-2通路。6)在正常VSMCs中共转染Ad-NANOG/mi R-20a inhibitor,TIMP-2表达增加,MMP-2活化受到抑制,细胞侵袭能力下降。在正常VSMCs中共转染Si-NANOG/mi R-20a mimic,TIMP-2的m RNA表达抑制,蛋白表达下降,MMP-2活化增加,细胞侵袭能力增加。研究结论:我们的实验研究结果提示NANOG转录调控mi R-20a,抑制TIMP-2的表达,促进MMP-2活化,导致主动脉ECM过度降解,从而参与ATAD的发生。