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肝癌（Liver cancer,LC）发病率与死亡率均高居所有恶性肿瘤前列,大部分LC患者临床初次确诊即为中晚期,病程发展迅速。目前LC的临床治疗方法取得一定进展,由于LC的高复发与转移特点,临床预后依然较差。研究表明LC发生发展和复发转移均与LC的干性密切相关。LC干性是指肝癌干细胞（liver cancer stem cells,LCSCs）亚群,其具有自我更新能力、多能性和耐药性,可介导LC发生、发展、复发与转移。因此抑制LCSCs进而降低肝癌干性是有效降低肝癌的发生发展及改善预后的重要治疗策略。谷氨酸草酰乙酸氨基转移酶（Glutamic-Oxaloacetic Transaminase2,GOT2）是苹果酸-天冬氨酸穿梭系统中（Malate-aspartate shuttle）的重要转氨酶,可维持胞内的氧化还原平衡与NAD+/NADH比例。课题组前期发现中药小分子滇西八角坤可通过GOT2抑制LCSCs增殖,因此本课题旨在阐明GOT2蛋白与LC干性之间的关系,深入探索GOT2蛋白调控的关键干性基因及其可能的机制,以期阐明GOT2在维持LC干性中的重要作用。为揭示滇西八角坤等中药活性成分抑制LCSCs的研究提供重要前期数据和理论支持。本研究主要分为三部分:1.GOT2稳转细胞株的建立及LCSCs的获得使用RNA干扰（RNA interference,RNAi）建立稳转细胞株。首先考察GOT2在多种不同LC细胞系中的表达,明确应用于本研究的体外细胞模型,其次建立GOT2敲低稳转细胞株的最佳条件。在前期已建立的Hep3B与Huh7过表达稳转株的基础上,选择HCC-LM3细胞株建立全新的过表达与敲低稳转细胞株。通过对嘌呤霉素浓度以及感染复数（Multiplicity of infection,MOI）值的探索,确定使用嘌呤霉素4μg/m L,MOI为10作为感染条件建立相关稳转株。根据文献和前期研究基础,富集获得悬浮成球的LCSCs。2.GOT2在肝癌中的作用及其对LC干性的影响本部分研究将首次系统性研究GOT2在LC发生发展过程中的重要作用,并探索GOT2对LCSCs关键干性因子的调控作用。首先使用基因表达谱交互分析数据库（Gene Expression profiling Interactive Analysis,GEPIA）查询GOT2在LC及癌旁组织中的表达及其对预后的影响。结果显示,LC较癌旁组织中GOT2的表达无显著变化,但与LC的总生存率与无病生存率呈显著正相关,后续将通过体内外实验评价GOT2在LC中的作用。结果显示,GOT2过表达增强LC细胞的克隆形成、侵袭及迁移,同时GOT2敲低抑制LC细胞的克隆形成、迁移,体内实验表明敲低GOT2可显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤生长。以上结果表明GOT2具有促进LC进展的重要作用。进一步探索GOT2对LC干性的影响,检测GOT2对LCSCs成球能力及干性标志物的变化。结果显示GOT2敲低后,LCSCs的成球能力显著降低,相关干性标志物CD133、CD24、上皮细胞粘附因子（Epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM）、含有富含亮氨酸重复的G蛋白受体5（Leucine-rich repeat-containing G-protein receptor5,LGR5）、醛脱氢酶1家族成员1（Aldehyde dehydrogenase 1 A,ALDH1A）和干性基因八聚体结合转录因子4（Octamer-binding transcription,OCT4）、性别决定区Y box-2（Sex determining region Y-box 2,SOX2）、NANOG的m RNA水平明显下降。体内外实验考察GOT2敲除后LCSCs干性基因蛋白水平的变化,结果显示GOT2敲除可显著降低干性基因SOX2的蛋白水平,而干性基因OCT4与NANOG的蛋白水平无显著变化,因此后续将聚焦LCSCs干性基因SOX2阐明GOT2调控肝癌干性的机制。3.初步探索GOT2调控干性基因SOX2的潜在机制干性基因SOX2是LCSCs中重要干性基因。结合前期实验结果,本部分研究进一步探索GOT2调控SOX2蛋白表达的机制。首先使用蛋白质组学检测GOT2敲除前后的差异蛋白,进行生物信息学分析。结果显示KEGG富集分析聚焦单磷酸腺苷活化蛋白质激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）等相关信号通路,其主要依赖AMP激活。推测GOT2可通过AMPK实现干性基因SOX2的调控,因此考察GOT2对单磷酸腺苷活化蛋白质激酶α（AMP-activated protein kinaseα,AMPKα）蛋白水平的影响。然而,结果显示GOT2敲除与过表达后AMPKα均无明显变化,提示GOT2可不依赖AMPK信号通路调控SOX2的表达。结合文献分析发现,c-Myc可促进SOX2的核内转录,因此通过核质分离实验检测GOT2过表达后c-Myc核内、外的表达量变化。结果显示GOT2过表达后,c-Myc核内的表达未见明显升高,以上结果提示GOT2不通过c-Myc调控SOX2的核内转录调控。最后又采用放线菌酮追踪实验（Cycloheximide chase assays,CHX）进行了SOX2蛋白质半衰期的检测。结果显示GOT2敲低后,SOX2蛋白稳定性显著降低,表明GOT2可能是通过增加SOX2蛋白的稳定性上调了SOX2的表达。综上,本研究成功建立了GOT2稳定表达的LC细胞株,并明确了GOT2可显著促进LC细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并可加速LC荷瘤小鼠体内的肿瘤生长。进一步研究发现GOT2可显著促进LC干性,上调LCSCs干性基因SOX2的表达,且其主要机制可能是GOT2增加SOX2稳定性。该论文阐明了GOT2在维持LC干性中的重要作用,为GOT2作为LC治疗新靶点提供重要前期数据和理论支持,同时为进一步开展靶向GOT2抑制LC干性发挥抗肿瘤作用的中药小分子的研究提供重要前期数据。