背景:卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一,发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,致死率高居妇科恶性肿瘤死亡率之首。卵巢癌的高死亡率主要是由于卵巢位于盆腔深部,早期的症状不易被及时发现,病情发展十分隐匿,且缺乏有效的早期筛查手段,70%的卵巢癌患者就诊时已是晚期,伴有盆腹腔转移,因此卵巢癌有“沉默杀手（silent killer）”之称。90%的卵巢癌属于卵巢上皮性癌,主要治疗手段是手术联合铂类和（或）紫杉醇为主的化疗,但由于患者确诊时多为晚期伴有转移错过最佳手术时机,且化疗耐药的普遍发生,卵巢癌的5年总体生存率仅有39%,严重威胁女性健康。流行病学和临床研究表明患病导致的焦虑、缺少社会支持等心理应激事件促进了肿瘤的进展。应激刺激激活交感神经系统（SNS）和下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）,导致体内应激激素（肾上腺素和糖皮质激素等）水平增高。已有的研究表明肾上腺素能直接促进多种肿瘤（如前列腺癌、直肠癌与卵巢癌等）的增殖、存活（抗凋亡）、迁移、侵袭和转移等。糖皮质激素（Glucocorticoid,GC）不仅在应激时在血浆中明显增高,且作为抗炎（治疗风湿性关节炎、哮喘和炎症性肠病等）和免疫抑制剂（治疗系统性红斑狼疮等）在临床中被广泛使用,GC也可作为肿瘤化疗治疗的辅助药物,以减少化疗引起的副作用（恶心、呕吐及过敏反应等）。GC的作用通过GC受体（glucocorticoid receptor,GR）介导,GC能激活GR,使得GR入核以二聚体的形式与靶基因启动子中的GC反应元件（glucocorticoid response element,GRE）结合,进而调节基因表达;GR还可以通过与其他转录因子（如NF-κB和AP-1等）相互作用而间接地调节基因表达。GC对实体肿瘤的作用十分复杂,既往研究表明GC可抑制机体免疫系统,降低机体的免疫监视功能,进而导致肿瘤细胞免疫逃逸,促进肿瘤进展。GC具有强大的抗炎作用,能通过抑制细胞因子和炎症介质的生成,减轻肿瘤的炎症微环境,抑制肿瘤的增殖和进展。Hidalgo等人的研究发现处于肿瘤微环境中的成纤维细胞的GR转录活性明显增加,促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。此外,GC还能促进细胞在不利微环境（如低氧、低血清）下的存活和增强多种肿瘤细胞（如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌等）对化疗药的抵抗。GC还能直接作用于肿瘤细胞,如GC能直接抑制多种肿瘤细胞（如卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和肾癌等）的增殖,但GC对肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移作用促进和抑制均有报导。有研究指出在人肿瘤细胞异种移植的联合免疫缺陷（SCID）小鼠模型中,GC能抑制胰腺癌、神经胶质瘤和膀胱癌的进展和转移。但是在人肿瘤异种移植的裸鼠乳腺癌转移模型中,转移病灶中糖皮质激素受体（glucocorticoid receptors,GR）明显被激活,进一步构建稳定敲减GR乳腺癌细胞株进行实验发现,GC依赖于GR激活受体络氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）进而促进乳腺癌肺转移。而除了此通路之外,也有研究发现GC可以通过激活PI3K/SGK1/CTGF通路促进乳腺癌肺转移,并且在转移瘤模型中GC联合紫杉醇处理后裸鼠肺部转移病灶数目较单纯紫杉醇处理组明显增多,说明GC在促进乳腺癌紫杉醇化疗耐药及转移。化疗前给与GC用药的乳腺癌患者的癌细胞中SGK1及MKP1的蛋白水平明显上升,干扰SGK1与MKP1表达后,GC促进紫杉醇化疗耐药的作用明显被削弱。Wnt/β-catenin信号通路调控重要的生理过程如细胞分化、细胞运动和细胞极性等,其异常激活可以促进肿瘤的转移、癌细胞存活及化疗耐药等。经典的Wnt信号通路是一个高度保守的复杂级联反应过程,在成熟的细胞中,Wnt通路处于关闭状态,细胞浆中的β-catenin大部分与细胞膜上的E-cadherin结合,少部分β-catenin的33位、37位丝氨酸以及41位苏氨酸在GSK3β/APC/Axin复合体中被糖原合酶激酶3β（GSK3β）磷酸化,随后发生泛素化后经蛋白酶体降解。当Wnt配体或其他细胞表面受体与Frizzled结合时,Wnt信号通路被激活,可以抑制GSK3β/APC/Axin复合体对β-catenin的磷酸化,从而稳定β-catenin的表达;在胞浆中积累的β-catenin便会转移到细胞核中,与细胞核内T细胞因子/淋巴样增强因子结合因子（TCF/LEF）家族成员形成复合物,调节下游靶基因的表达。对TCGA卵巢癌数据库及裸鼠卵巢癌转移瘤模型进行转录测序结果富集分析提示卵巢癌的进展和转移与β-catenin信号通路激活呈正相关,敲减β-catenin后,卵巢癌SKOV-3细胞在体内外的迁移能力均显著降低,说明β-catenin的激活促进了卵巢癌的转移。亦有研究发现E-cadherin和β-catenin的活性与表达水平在卵巢癌细胞EMT的启动中至关重要,而EMT被认为是转移的起始步骤,由此推测β-catenin可能通过EMT影响卵巢癌的转移。此外,有研究显示在直肠癌细胞中,细胞核中β-catenin蛋白表达显著增多,并且与MMP-7的m RNA水平呈正相关,在缺乏β-catenin蛋白积累的细胞中没有发现MMP-7的表达,提示MMP-7是β-catenin的下游靶基因。β-catenin除了与肿瘤转移密切相关,有研究也发现干扰乳腺癌细胞中β-catenin的表达后,可以增加caspase3/9蛋白表达进而增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性。我校病理生理实验室前期研究证实GC可以促进巢癌细胞的侵袭转移与化疗耐药,但是具体的作用机制还不十分明确。本课题在此基础上进一步探讨了GC对β-catenin表达和定位的调节与机制,以及β-catenin是否参与了GC促进卵巢癌细胞迁移、侵袭、转移和化疗耐药。方法:首先在卵巢癌SKOV-3与HO-8910细胞系中进行体外实验,100n M地塞米松（Dexamethasone,Dex,人工合成的GC）处理细胞,为去除血清中激素对细胞的影响,我们使用含10%去激素血清的培养基培养细胞,采用RT-QPCR检测β-catenin、Wnt4与Wnt5a的m RNA水平。Western Blot方法检测蛋白的表达和蛋白磷酸化水平。Transwell小室检测细胞的垂直迁移能力。Transwell侵袭小室检测细胞的侵袭能力。抑制剂抑制相关信号通路的激活。CCK-8检测细胞增殖能力。细胞免疫荧光检测β-catenin的细胞定位情况。采用4周龄的BABL/c雌性裸鼠腹腔注射嘌呤霉素筛选的带荧光素酶标记的稳定表达β-catenin-sh RNA或随机片段干扰的的卵巢癌细胞,饮水中加入皮质酮（小鼠体内的糖皮质激素）来升高裸鼠体内血浆中的皮质酮水平。ELISA检测裸鼠血浆中皮质酮水平。HE染色确定转移灶的病理性质。免疫组化检测β-catenin在荷瘤裸鼠卵巢组织中的表达与分布。结果:第一部分:糖皮质激素上调β-catenin促进卵巢癌细胞迁移、侵袭和转移1.人工合成的GC-地塞米松（Dex）在体内外均可以增加β-catenin蛋白的表达和核定位。2.β-catenin抑制剂PNU74654可以完全阻断GC对卵巢癌细胞迁移和侵袭促进作用。3.在BABL/c裸鼠腹腔注射卵巢癌细胞制备的转移瘤模型中,干扰β-catenin的表达阻断了GC在体内对卵巢癌细胞的促肝脏转移作用。4.β-catenin抑制剂PNU74654可以部分阻断GC导致的卵巢癌细胞化疗耐药的作用。第二部分:糖皮质激素上调β-catenin促卵巢癌细胞转移的机制研究1.GC能上调基质金属肽酶MMP-3和MMP-7的蛋白表达,但不影响MMP-2和MMP-9的蛋白表达。2.GC上调间质细胞标志物vimentin和N-cadherin的蛋白表达减少上皮细胞标志物E-cadherin的蛋白表达。3.PNU74654抑制β-catenin信号通路后,GC上调N-cadherin、Vinmentin、MMP-3与MMP-7蛋白以及下调E-cadherin蛋白的作用均被抑制。第三部分:糖皮质激素上调卵巢癌细胞中β-catenin的机制研究1.在卵巢癌细胞中,GC能下调β-catenin第33位与37位丝氨酸的磷酸化水平。2.GC上调GSK3β第9位丝氨酸的水平。3.GC不影响Wnt通路配体Wnt4与Wnt5a的m RNA与蛋白表达。4.MK2206抑制AKT信号通路后,完全阻断了GC对GSK3β活性的抑制（降低了GSK3β9位丝氨酸的磷酸化水平）,降低了β-catenin的蛋白表达。结论:β-catenin信号通路的激活介导了糖皮质激素促进卵巢癌细胞侵袭转移和化疗耐药。同时糖皮质激素可以经β-catenin促进卵巢癌细胞EMT的发生以及MMP-3和MMP-7蛋白表达的增加。在卵巢癌细胞中,GC是通过激活AKT信号通路,抑制GSK3β的活性,减少β-catenin丝氨酸33和37位磷酸化,抑制其蛋白酶体降解,进而增加β-catenin蛋白水平。