研究背景及目的龋病是一种牙体硬组织慢性进行性破坏的疾病。尽管我国居民的口腔健康保健意识已得到提高,但患龋状况仍呈上升态势。变异链球菌（Streptococcus mutans,S.mutans）是最主要的致龋菌。生态菌斑学说指出,牙菌斑生物膜中占优势的致龋菌代谢产生过多的酸,导致局部硬组织脱矿是龋病发生的最直接原因。现有的防龋药物包括了氟化物,它能够促进牙釉质的再矿化,但它并不具有明显的抗致龋菌作用。而其他防龋药物也具有局限性,比如抗生素易产生耐药菌株、难以杀灭生物膜状态的细菌,以及长期使用洗必泰可引起牙面着色和味觉异常等发生。因此,我们需要寻找安全有效的新型防龋药物,比如抗菌肽。抗菌肽是一类具有正电性、疏水性和两亲性的小分子多肽类物质。它们不仅能够有效抑制多种革兰氏阳性/阴性细菌的活性,甚至对传统抗生素耐药菌也有良好的抑制效果。其中研究最多的是α-螺旋型抗菌肽,它主要是通过破裂菌膜的机制来发挥抗菌作用,从而具有杀菌快速、不易产生耐药菌的优势。用于抗S.mutans研究的抗菌肽主要包括了天然抗菌肽、衍生肽和专一性靶向S.mutans的抗菌肽。然而,由于存在着合成消耗大（肽链较长）和生物利用度低（空间位阻）等不利于临床转化的因素,目前仍没有抗S.mutans的抗菌肽能够完全进入临床应用阶段。这就需要我们继续去寻找和研发更多的抗菌肽,特别是线性短肽。Reuterin 6和Gassericin A是口腔共生菌乳酸杆菌拮抗S.mutans等致龋菌时分泌的、由同一氨基酸序列组成、但空间结构不尽相同的环状细菌素。鉴于它们的提取和合成工序较为复杂、消耗大,故优化此抗菌肽是目前较好的选择。本课题根据两亲性正电性α-螺旋结构抗菌肽的设计理念来截取Reuterin 6和Gassericin A中的活性区域,然后根据正电性、疏水性、两亲性和不完美两亲性的原则来设计、合成了一系列短链线性抗菌肽,其中抗菌肽LR-10最符合低毒高活性和杀菌快速的要求。并进一步研究LR-10对浮游态和生物膜状态的S.mutans的抑制效果、对戈登链球菌、黏性放线菌和牙龈卟啉单胞菌等其他口腔致病菌的影响、对口腔局部生理环境的耐受性和诱导耐药性发生的能力;以及评估LR-10的生物相容性和探究其抗菌机制。因此本课题的目的是研发出有利于临床转化的抗S.mutans的肽类药物。第一章 Reutercin 6和Gassericin A来源的α-螺旋型衍生肽的设计与筛选目的构建并筛选出低毒高活性、杀菌快速的目标抗菌肽,为后续研究抗菌肽的抗S.mutans的作用和机理奠定基础。方法1.将乳酸杆菌拮抗S.mutans等致龋菌的代谢产物Reuterin 6和Gassericin A作为设计的初始模板,截取经Prabi网站预测后的α-螺旋结构,并在Heliquest网站模拟的螺旋图结果上根据两亲性正电性α-螺旋结构抗菌肽的设计理念进行设计,以此构建一系列Reuterin 6和Gassericin A来源的衍生肽,并分析它们的理化性质等;2.检测各个抗菌肽的最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentrations,MICs）和最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentrations,MBCs）。在96孔板上将生长对数期的S.mutans UA159与倍比稀释的抗菌肽进行均匀混合、厌氧培养24-48 h,取所有肉眼无浑浊的孔中液体涂于BHI琼脂平板,再培养2-3 d;3.检测各个抗菌肽对HPDFs产生的细胞毒性,用它们的CC50进行比较。在96孔板上将2-4代的HPDFs与倍比稀释的抗菌肽进行均匀混合、孵育48 h,按照CCK8说明书操作,读取各孔的OD450值;4.检测各个抗菌肽的杀菌速率,用存活率进行比较。在96孔板上将生长对数期的临床分离株S.aureaus与浓度为1× MBCs的候选抗菌肽进行快速混合后便开始计时,在0、5、10、20、40、60、100、160、220、300和360 min时各取菌液稀释、涂板,需氧培养2d后读取存活菌落数。结果1.截取活性区域后得到LR-1,然后通过氨基酸替换的方式成功构建了5条完美两亲性抗菌肽LR-2、LR-3、LR-6、LR-7和LR-8,以及4条不完美两亲性抗菌肽LR-4、LR-5、LR-9和LR-10,其中LR-4和LR-5的不完美两亲性偏弱。2.多数LR-1衍生肽具有良好的抗S.mutans UA159活性,尤其是LR-7、LR-9和LR-10。它们的抗菌活性主要取决于它们的疏水性,即疏水性越高,抗菌肽的抗菌活性越强。同时,不完美两亲性的结构并不会影响α-螺旋结构型抗菌肽的抗菌活性。3.随着抗菌肽的疏水性增加,LR-1衍生肽产生细胞毒性便越高。而不完美两亲性抗菌肽产生的细胞毒性普遍偏低,其中LR-9和LR-10具有最低的细胞毒性。4.LR-1衍生肽的杀菌速率与其疏水性成正比。而不完美两亲性能够进一步提高杀菌速率,比如LR-9和LR-10的杀菌速率最快。第二章 LR-10对浮游状态变异链球菌的抗菌作用研究目的探究目标抗菌肽LR-10用于抗变异链球菌的作用。方法1.检测LR-10、LL-37和pleurocidin等药物的MICs和MBCs。在96孔板上将生长对数期的S.mutans UA159与倍比稀释的药物进行均匀混合、厌氧培养24-48 h,取所有肉眼无浑浊的孔中液体涂于BHI琼脂平板或eBHI血平板,再培养2-3 d;2.检测了LR-10、氯己定和红霉素对S.mutans UA159的耐药性诱导能力。第1代进行的耐药性诱导实验步骤跟检测MICs的实验步骤一致,后面重复检测0.5× MICs中的S.mutans UA1 59与倍比稀释的药物作用后的MICs,连续检测20代,记录每一代的MICs;3.检测LR-10、氯己定和红霉素的杀菌速率以及LR-10对三种口腔链球菌（S.mutans UA159、S.sobrinus和S.gordonii）的杀菌速率,用存活率进行比较。在96孔板上将生长对数期的S.mutans UA159与药物进行快速混合后便开始计时,在0、10、20、30、45、60、90、180和300 s时各取菌液稀释、涂板,厌氧培养2d后读取存活菌落数。按照同样方法,也进行了LR-10对S.mutansUA159和ATCC25175、S.sobrinus ATCC33478和S.gordonii ATCC10558的杀菌速率的比较;4.检测了LR-10在模拟的口腔生理环境（NaCl、pH和唾液）下的杀菌能力。NaCl组的NaCl浓度分别是50、100、200、300和400 mM;酸性条件组的pH分别是5.0、5.5和6.0。我们检测了在不同浓度的NaCl、不同的酸性条件和体外唾液环境下LR-10在10 s内的杀S.mutans UA159速率。5.利用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验的方法,P＜0.05代表具有统计学差异。结果1.除了LL-37无明显的抗S.mutans UA159活性以外,其他现有的抗菌肽对S.mutans UA159的抗菌活性（MICs）范围是4.6-100.4 μM。同时LR-10也对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌等口腔致病菌表现出与其抗S.mutans UA159相一致的抗菌活性。2.经过连续20代的耐药性诱导,仍不能产生对LR-10有耐药性的S.mutans UA159;而经过同样处理的红霉素能够诱导产生16384倍耐红霉素的S.mutans UA159。3.LR-10抗S.mutans等口腔条件致病菌或致病菌的MBCs与MICs的比值均为2,说明了LR-10具有较强的杀菌能力。它在10 s内即可抑制97%以上的S.mutans UA159的活性。并且,同样在10 s的处理时间内LR-10对S.mutans的杀菌速率高于对S.sobrinus和S.gordonii的杀菌速率的1.2-2.8倍。4.在模拟的口腔生理环境下,LR-10完全保持了抗S.mutans UA159的活性。这些结果均与LR-10在人新鲜洁净唾液中的结果相一致,即唾液对LR-10的抗S.mutans UA159的活性无明显影响。与此同时,我们还发现了进一步提高NaCl的浓度（比如升高到400 mM）以及进一步增加酸的浓度（比如pH值降低到5.0）,LR-10仍能够保持高效的抗S.mutans UA159活性。第三章 LR-10抗变异链球菌生物膜能力的研究目的研究LR-10的抗S.mutans生物膜能力,包括了抑制生物膜形成和清除成熟生物膜的能力,从而再次验证LR-10的抗S.mutans优势。方法1.检测LR-10、氯己定和红霉素的抑制S.mutans UA159生物膜形成能力。在96孔板上将生长对数期的S.mutans UA159与各自对应浓度为0.6×、0.8×、1×和2× MBCs的药物进行均匀混合、厌氧培养24 h,后续进行生物膜的清洗、固定、结晶紫染色和乙醇溶解。测各孔的OD595,结果用生物膜形成率表示;2.检测S.mutans UA159生物膜在人唾液中形成时受到LR-10的抑制程度。首先在96孔板上、BHI-唾液培养基中进行4 h的S.mutans UA159生物膜形成,接着加入0.8×、1×和2× MBCs的LR-10处理10 s后移除反应液,最后加入新鲜BHI-唾液培养基后开始计时,每隔1小时测一次各孔的OD600,直至24小时,并以此绘制S.mutans UA159生物膜的生长曲线。3.检测LR-10、氯己定和红霉素的清除成熟S.mutans UA159生物膜的能力。首先在96孔板上、BHI-唾液培养基中进行24 h的S.mutans UA159生物膜形成,接着加入0、1×、2×、4×、8×和10× MICs的各种药物处理24h后刮取生物膜,稀释、涂板,厌氧培养2d后读取存活菌落数,结果用存活菌落数的1g形式表示;4.验证LR-10是否也能够在唾液中快速清除成熟的S.mutans生物膜。成熟的S.mutns UA1 59生物膜预先在BHI-唾液培养基中形成24h,然后加入含LR-10（终浓度均为1×、2×、4×、8×和10× MICs）的BHI-唾液溶液,处理10 s,同样刮取生物膜后进行菌液的稀释、涂板,厌氧培养2 d后读取存活菌落数,结果用存活菌落数的1g形式表示;5.使用扫描电镜（Scanning electron microscopy,SEM）进行成熟的S.mutans UA159生物膜的形态学观察。首先在无菌细胞爬片上进行24h的S.mutans UA159生物膜形成,接着加入10× MICs的LR-10、氯己定或红霉素处理24 h后进行生物膜清洗、固定和脱水,最后使用SEM观察;6.利用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验的方法,P＜0.05代表具有统计学差异。结果1.LR-10、氯己定和红霉素呈剂量依赖性抑制S.mutans UA159生物膜形成。当使用浓度为0.8× MIC的LR-10处理24 h时,它将会完全抑制S.mutans UA159生物膜的形成。相反地,红霉素需要提高浓度至2× MIC时才能完全抑制S.mutans UA159生物膜的形成。2.相比较于未作任何处理的S.mutans UA159生物膜形成,浓度为2× MIC（相当于1× MBC）的LR-10大大地减少形成的生物膜量。比如,在检测的终末时间（24h）,0.8×、1×和2× MIC的 LR-10分别能够抑制了23.3%、25.2%和46.5%的S.mutans UA159生物膜形成。3.LR-10、氯己定和红霉素呈剂量依赖性清除成熟的S.mutans UA159生物膜。当使用浓度为1×、2×、4×、8×和10× MICs的LR-10处理24h时,它能够抑制了0.3-log10到1.9-log10的生物膜中S.mutans UA159的活性。而浓度为10× MICs的氯己定和红霉素仅分别抑制了 1.3-log10和1.1-log10的生物膜中S.mutans UA159的活性。4.当使用浓度为1×、2×、4×、8×和10× MICs的LR-10处理10 s时,它能够抑制0.4-log10到2.1-log10的生物膜中S.mutans UA159的活性,同时这些结果与处理24 h时的结果相似。5.LR-10处理后的S.mutans UA159生物膜,出现了细胞网络的连续性被严重破坏、细胞零星散落和胞外聚合物变得非常疏松的情况,同时细胞团块由于活细胞数目大大减少而难以成团。第四章 关于LR-10的细胞毒性和抗菌机制的研究目的研究目标抗菌肽LR-10的细胞毒性和抗菌机制,为体内实验提供理论依据。方法1.检测LR-10的溶血活性。在96孔板上分别使用PBS或IGF缓冲液对LR-10进行倍比稀释,然后加入PBS或IGF缓冲液重悬过的新鲜兔红细胞,0.5%Triton X-100组被设立阳性药物组,在37℃、含5%CO2的潮湿环境中孵育1 h之后离心、测各孔上清的OD405,结果用溶血率表示;2.检测LR-10对HGFs和HPDFs产生的细胞毒性。在96孔板上分别将2-4代的HGFs、HPDFs与倍比稀释的LR-10进行均匀混合,阿霉素组被设立为阳性药物组,孵育24、48和72h后按照CCK8说明书操作,读取各孔的OD450值;3.检测LR-10破坏S.mutans UA159细胞膜完整性的能力。在EP管中将生长对数期的S.mutans UA159分别与0.5×、1×和2× MBCs的LR-10进行均匀混合,pleurocidin组被设立为阳性药物组,厌氧培养10、30、60、90和180 s后加入PBS以终止药物反应,然后离心、清洗和PI染色,最后使用流式细胞仪进行PI-阳性细胞率的检测;4.使用SEM进行S.mutans UA159经LR-10作用后的形态学观察。首先在EP管中将生长对数期的S.mutans UA159与2× MBCs的LR-10进行均匀混合,处理1 h后进行离心、菌体清洗、固定和脱水,最后使用SEM观察;5.利用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验的方法,P＜0.05代表具有统计学差异。结果1.当使用浓度不高于6.5 μM的LR-10处理时,它在PBS或IGF中均具有较低的溶血活性。然而浓度进一步提高时,LR-10对兔红细胞的溶血活性也会相应地增加。2.当使用浓度不高于13.1 μM的LR-10处理时,它在72 h内不会对HGFs和HPDFs造成明显的细胞活性降低。然而浓度进一步提高时,LR-10对HGFs和HPDFs产生的细胞毒性也会相应地增加。相比来说,阿霉素在72 h内即可降低大约90%的HPDFs和HGFs的活性。3.LR-10呈时间和剂量依赖性增加S.mutans UA159菌膜的通透性。无论是使用浓度为1× MBCs的LR-10处理90 s,抑或是使用浓度为2× MBCs的LR-10处理60s,它均能够形成高于90%的PI-阳性细胞率。而pleurocidin在180 s内形成的PI-阳性细胞率较低。4.相比于完整的S.mutans UA1 59细胞膜,经LR-10处理后,S.mutans UA159的细胞膜出现极大的变化,包括出现了细菌变形、菌膜上出现了小的孔洞和细菌溶解、细菌碎片聚集成团,而这些变化均为菌膜破裂的过程。结论1.我们选择了抗菌活性较好、细胞毒性较低和杀菌速率较高的LR-10作为我们后续研究的目标抗菌肽。2.LR-10具有优于现有的抗S.mutans的抗菌肽的抗菌效果、有效抑制多种口腔致病菌的活性和不易引起耐药性的发生的特点。3.LR-10具有显著的杀菌能力,以及短时间内抗S.mutans的选择性。4.LR-10在模拟的口腔生理环境中仍保持良好的抗S.mutans的活性。5.LR-10能够高效抑制S.mutans UA159生物膜的形成。6.LR-10能够有效清除成熟的S.mutans UA159生物膜。7 有效浓度内的LR-10对哺乳动物的真核细胞和人口腔细胞产生的毒性较低。8 LR-10能够通过破裂菌膜来发挥抗S.mutans作用。