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背景和目的:H9N2亚型禽流感病毒在欧亚特别我国禽类普遍存在,该病毒虽属低致病性,但可以直接感染人,还可作为“孵化器”,容易与其它甲型流感病毒亚型发生基因重配,形成传播人类的禽流感病毒H5N1、H7N9、H5N6和H10N8。因此,H9N2病毒可能成为引发新一轮全球流感的罪魁祸首,研究人员除了提防高致病性禽流感病毒H5N1、H7N9,也要对低致病性禽流感病毒H9N2的潜在巨大威胁引起足够重视。鸭属“半陆禽”动物,其在H9N2病毒从水禽动物传播至陆禽、哺乳动物中起非常重要作用。本项目应用鸭源禽流感病毒H9N2亚型体内感染昆明小鼠,体外感染正常人呼吸道组织,观察病毒是否对小鼠产生致病性以及在人呼吸道组织中有效复制,探索H9N2亚型禽流感病毒跨种属直接从水禽感染人的潜能。研究方法:1.本实验选择了2株水禽鸭源H9N2亚型禽流感病毒DK/GX/527/2012（简称GX527）、DK/GX/4095/2012（简称GX4095）作为实验病毒株,同时选陆禽鹌鹑QA/GX/3139/2012（简称GX3139）作为阳性对照。将病毒接种到10 d鸡胚进行扩增,培养48 h后收集尿囊液测定病毒效价。2.TCID50检测:测定病毒TCID50值,以明确本次研究中体内实验和体外实验所需要的病毒稀释度。3.H9N2亚型流感病毒感染昆明小鼠:通过鼻腔内、眼睛途径接种KM（Kunming mice,KM小鼠）,实验组和阳性对照组每组12只KM小鼠,每只小鼠接种200μl病毒稀释液,空白对照组8只小鼠分别接种接200μl PBS,接种后每天记录小鼠的身体状况,第1、3、5、7 d分别采集所有实验小鼠咽部拭子,第3、5、7 d分别选择了实验组和阳性对照组各3只小鼠、空白对照组2只小鼠,乙醚麻醉后用眼球采血法采血,再用颈椎脱臼法处死。小鼠处死后无菌采集气管和肺组织,每份标本分成两份,一份浸泡于10%福尔马林溶液中进行固定,用于免疫组化检测病毒核蛋白（Nucleoprotein,NP）抗原以及作苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,HE）染色观察组织是否发生病理变化,另一份用研磨棒直接研磨后加入采样液,保存于-80℃冰箱以备分离病毒。第14 d剩余小鼠全部采集血样并处死,采集的血液4℃静置12 h后3000 rpm离心10 min,收集血清。4.H9N2亚型流感病毒在体外正常人呼吸道组织的复制:取新鲜手术后人肺部及支气管组织,将病毒稀释液接种人呼吸道组织,分别于接种后12 h,24 h,36 h,48 h和72 h 5个时间点取组织培养液和组织块,每个时间点收取接种病毒后组织2块,其中一块进行研磨后加入病毒保存液,置于-80°C冰箱冻存,使用前离心取上清。另一组织块浸泡于10%福尔马林中,进行固定24 h以上用作后期病毒核蛋白NP抗原的检测和HE染色观察组织是否发生病理变化。5.流感病毒的分离:将小鼠咽拭子、小鼠组织研磨液、组织培养液以及人呼吸道组织研磨液均分为两份,一份接种10 d鸡胚,培养48 h后收集鸡胚尿囊液,采用病毒血凝素试验（HA试验）检测病毒滴度;另一份接种于MDCK细胞,培养72 h后,取细胞培养液离心后作HA试验,检测细胞培养液中病毒滴度。6.红血球凝集抑制试验检测小鼠血清抗体效价:分别于小鼠接种病毒后第3、5、7、14 d,将小鼠用乙醚浅麻醉,摘掉小鼠眼球取全部血样,离心取上层血清,应用红血球凝集抑制试验检测小鼠血清抗体效价。7.免疫组化染色测组织病毒NP抗原:将10%福尔马林固定后的小鼠标本制作组织切片,作免疫组化染色,显微镜下观察病毒NP抗原表达情况。8.HE染色观察感染病毒后组织的病理变化:上述10%福尔马林固定的小鼠呼吸道组织、人呼吸道组织,石蜡包埋、切片,HE染色,在显微镜下观察组织是否发生病理变化。结果:1.昆明小鼠体内感染实验中,GX4095亚型禽流感病毒株可感染昆明小鼠,使小鼠出现食欲减退、体重不增、背毛杂乱等症状。小鼠呼吸道肺和气管标本研磨液接种鸡胚,病毒分离培养呈阳性;免疫组化显示小鼠呼吸道肺组织、支气管及气管上皮细胞内病毒NP抗原阳性;HE染色显示病毒攻毒后小鼠气管出现上皮细胞脱落、管腔内炎症细胞浸润,肺组织和支气管出现白细胞增多等炎症反应。GX527亚型禽流感病毒株感染小鼠后,接种鸡胚和MDCK细胞的样本病毒分离培养结果全部为阴性;免疫组化检测肺组织、支气管和气管上皮细胞内NP抗原均呈阴性;HE染色显示小鼠攻毒后气管和支气管无明显病变,肺组织出现轻度炎症反应改变。HI实验检测攻毒3d、5 d、7 d和14 d的小鼠血样,2株病毒感染的所有昆明小鼠血清样本抗体全部阳性。2.体外正常人呼吸道组织病毒复制实验中,GX527、GX4095亚型病毒株感染后的组织培养液和组织研磨液样本经鸡胚接种后病毒分离检测均呈阳性;免疫组化显示肺组织细胞内病毒NP抗原阳性;HE染色显示2株病毒感染后人肺组织出现局部炎细胞反应,支气管中出现炎症细胞浸润、管壁细胞剥离等病变。结论:1.鸭源GX4095亚型病毒株（H9N2）可在小鼠呼吸道有效复制、引发呼吸道炎症病变,感染部位主要分布在小鼠的气管、支气管和肺组织,提示鸭源H9N2亚型流感病毒可直接从水禽跨种属感染哺乳动物昆明小鼠。2.鸭源H9N2亚型禽流感病毒可在人肺组织中有效复制,其中GX527亚型禽流感病毒株在人肺组织中流感病毒NP抗原表达明显,提示水禽鸭源H9N2亚型流感病毒具有跨种属直接感染人的潜能。