【摘 要】
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研究背景与目的动脉粥样硬化性疾病是动脉硬化最常见、最主要的一类疾病,也是冠心病、脑卒中发生的主要原因。与此同时,我国心血病患病率居高不下并持续上升,排在前两位的就是脑卒中和冠心病,但对动脉粥样硬化的具体机制仍未研究清楚,目前最具说服力是“损伤反应学说”。抑制局部炎症、减少炎症因子的刺激、清除炎症介质可以有效延缓动脉粥样硬化的进程。淋巴毒素β受体（LTβR）属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）
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研究背景与目的动脉粥样硬化性疾病是动脉硬化最常见、最主要的一类疾病,也是冠心病、脑卒中发生的主要原因。与此同时,我国心血病患病率居高不下并持续上升,排在前两位的就是脑卒中和冠心病,但对动脉粥样硬化的具体机制仍未研究清楚,目前最具说服力是“损伤反应学说”。抑制局部炎症、减少炎症因子的刺激、清除炎症介质可以有效延缓动脉粥样硬化的进程。淋巴毒素β受体（LTβR）属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）,是调节组织和器官内环境平衡的重要中间介质。LTβR是研究动脉粥样硬化的一个重要生物标志物。目前大量的研究结果表明,miRNA在动脉粥样硬化发生、发展过程中发挥着重要的作用,但鲜有LTβR与miRNA关系的研究。本研究通过构建血管平滑肌细胞炎症模型并沉默表达LTβR,检测NF-κB通路上的信号转导因子及细胞炎性因子的表达,筛选出差异表达miRNA,找出其靶点基因,找到可能存在的动脉粥样硬化的治疗靶点。方法1 细胞培养购买小鼠主动脉血管平滑肌细胞（MOVAS）,用CM1-1培养培养基进行培养。当细胞在10cm的细胞培养皿中铺满至80%时,将细胞消化后接种于6孔板中,用LPS处理0h、16h、24h后进行分组。2 RT-qPCRMOVAS的总RNA提取方法采用柱式法。采用M-MLV逆转录试剂行RNA逆转录。引物和Taqman探针采用primer express软件自行设计并由TaKaRa公司合成,目的基因表达量按2-ΔΔCt方法算出。通过RT-qPCR检测出各组细胞转染前后 LTβR、IL-18、VCAM-1 的表达。3 Western Blot通过Western Blot检测出各组细胞沉默表达LTβR前后的LTβR、p-p65、p65的表达情况,一方面验证转染是否成功,另一方面检测NF-κB通路蛋白的表达。4 ELISALPS处理各组细胞后,收集细胞上清液用ELISA方法检测IL-18的表达,明确炎症模型是否建立成功以及经炎症刺激后炎症因子的表达情况。5 小鼠miRNA测序分析用LPS处理24h后,收集NC（未处理组）、NC-LPS（LPS处理组）、shLTβR（病毒转染组）、shLTβR-LPS（LPS处理且病毒转染组）细胞行miRNA测序,筛选出差异表达的miRNA,并预测其靶点基因。结果1、用 LPS 处理 NC 组细胞 0h、16h、24h 后,行 RT-qPCR 检测 LTβR、VCAM-1、IL-18的mRNA表达,结果显示在16h组LTβR、IL-18的mRNA表达均较NC组显著上调,在24h组LTβR、IL-18、VCAM-1的mRNA表达均较NC组显著上调;ELISA检测提示,IL-18在24h组表达显著上调;采用Western Blot检测LTβR、NF-κB通路蛋白的表达,发现LPS处理16h和24h后,LTβR、p-p65表达均显著上调;而p65蛋白的表达变化不明显。2、用 LPS 处理 NC、shLTβR 组细胞 24h 后,将 shLTβR 组和 NC 组、shLTβR-LPS组和NC-LPS组相比较,ELISA结果提示:干扰LTβR的表达,均降低LPS引起的血清IL18含量的增加（p＜0.01）;RT-qPCR结果提示:LTβR的沉默表达可以降低 LPS 引起的 VCAM-1、IL-18 的 mRNA 表达上调（p＜0.01）;而 Western Blot结果同样提示干扰LTβR的表达,可以降低LPS引起的p-p65的基因表达上调（p＜0.01）;而p65蛋白的表达变化不明显。3、从 NC、NC-LPS、shLTβR、shLTβR-LPS 这 4 组细胞中提取 miRNA 测序发现,与NC组相比,miR-146b-5p、miRNA-27a-5p在shLTβR组中表达显著下调,与 NC-LPS 组相比,miRNA-146b-5p、miRNA-27a-5p 在 shLTβR-LPS 组中亦表达显著下调。结论1、在MOVAS炎症反应中,LTβR过表达,炎症因子表达上调。2、在LTβR能够通过上调p-p65蛋白的表达介导NF-κB的经典通路参与炎症反应。3、根据miRNA测序结果,我们认为LTβR通过增加miRNA-146b、miRNA-27a的表达,从而调控NF-κB通路介导动脉粥样硬化的炎症反应。
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