【摘 要】
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宰后成熟是牛肉自身改善嫩度的重要途径,在此过程中,Calpain和Caspase等内源性蛋白酶系统对骨架肌原纤维蛋白的水解促进了肌肉嫩化。AMPK（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase）是肌肉宰后启动断氧应答时首先被激活的蛋白激酶之一,活化的AMPK通过信号转导调控了下游复杂的生化过程和肉品质。但在成熟过程中,AMPK对牛肉嫩度的调
【基金项目】
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甘肃农业大学优秀博士论文培育计划项目（YB-2018003）； 国家自然科学基金地区基金（31760482）； 国家现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系项目（CARS-37）；
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宰后成熟是牛肉自身改善嫩度的重要途径,在此过程中,Calpain和Caspase等内源性蛋白酶系统对骨架肌原纤维蛋白的水解促进了肌肉嫩化。AMPK（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase）是肌肉宰后启动断氧应答时首先被激活的蛋白激酶之一,活化的AMPK通过信号转导调控了下游复杂的生化过程和肉品质。但在成熟过程中,AMPK对牛肉嫩度的调控途径和机制仍不清楚。本文以牛背最长肌为研究对象,探讨了AMPK对牛肉嫩度以及相关蛋白组的影响,进一步解析了AMPK介导的糖酵解代谢对Calpain-1活性的影响,并明确了AMPK在Caspase-3激活中的潜在调控途径,系统地阐明了AMPK在牛肉嫩化中的作用机理,对于揭示宰后成熟过程中断氧应答在牛肉嫩化中的调节途径以及确定调控牛肉嫩度的生物标记位点奠定了基础。主要研究结果如下:1.研究了AMPK对宰后牛肉嫩度及蛋白组的影响。牛肉AMPKα2的磷酸化水平在宰后6 h达最大（P＜0.05）。在宰后12 h前,AMPK的激活不利于牛肉嫩化（P＜0.05）,而在12 h后,活化的AMPK促进了牛肉嫩化,在168 h时,使牛肉的嫩度增加了15.75%（P＜0.05）。通过蛋白组学分析,牛肉宰后成熟过程中,AMPK参与的代谢途径主要有糖代谢、细胞骨架蛋白调节、细胞自噬、线粒体途径和氧化应激途径等,这些途径可能与牛肉嫩化有关。2.研究了AMPK对牛肉糖酵解及Calpain-1活性的影响。活化的AMPK通过磷酸化作用增加了GP（6 h）、HK和LDH（6～12 h）的活性（P＜0.05）,促进了GLUT4向细胞膜转移。宰后早期,AMPK促进了牛肌肉p H降低和肌浆蛋白变性（P＜0.05）,阻碍了Calpain-1的自溶（P＜0.05）,并且,肌肉的酸化限制了Calpain-1的催化活性（P＜0.05）。因此,AMPK通过增加GP、HK和LDH的活性以及诱导GLUT4蛋白向细胞膜转位,促进了糖酵解代谢和肌肉酸化,从而使肌浆蛋白变性增加,最终降低了Calpain-1自溶和活性,导致宰后12 h前牛肉嫩度降低。3.研究了AMPK介导的线粒体依赖性细胞凋亡对肌肉嫩度的影响。AMPK促进了宰后12～24 h内牛肉ROS积累（P＜0.05）,增加了6～12 h内线粒体膜上Bax/Bcl-2比值（P＜0.05）,诱导了牛肉线粒体功能障碍,促进了线粒体Cyt-c释放、胞质中Cyt-c的氧化以及Caspase-3激活（P＜0.05）。因此,活化的AMPK通过增加肌细胞ROS积累并诱导细胞质Bax向线粒体膜易位,增强了线粒体功能障碍,促进了线粒体Cyt-c的释放和氧化,进而促进了Caspase-3激活和细胞凋亡发生。在168 h时,AMPK通过线粒体依赖性细胞凋亡途径使牛肉嫩度改善了10.49%。4.在研究结果3的基础上,进一步解析了AMPK诱导的细胞自噬对线粒体依赖性细胞凋亡的影响。活化的AMPK下调了m TOR1复合物的含量,上调了ULK1的含量（P＜0.05）,促进了细胞自噬发生;但对Beclin-1含量的影响差异不显著。细胞自噬的发生促进了溶酶体膜失稳（P＜0.05）,增加了组织蛋白酶D活性、线粒体膜功能障碍、Caspase-3活性以及牛肉嫩化（P＜0.05）;但当组织蛋白酶D被抑制后,线粒体膜功能障碍、Caspase-3活性以及牛肉的嫩度均降低（P＜0.05）。因此,活化的AMPK通过ULK1通路促进了细胞自噬,并通过降低m TOR1复合物含量减少对ULK1-自噬途径的抑制作用;AMPK诱导的细胞自噬通过蛋白酶D促进了细胞凋亡和牛肉嫩化。5.研究了AMPK介导的内质网应激对Caspase-3激活以及牛肉嫩度的影响。宰后成熟过程中,活化的AMPK增加了IRE1的磷酸化水平（P＜0.05）,诱导了内质网应激;并通过激活下游Caspase-12和-9增加了Caspase-3活化（P＜0.05）,进而促进了肌原纤维蛋白降解和牛肉嫩化（P＜0.05）。在线粒体功能障碍诱导的凋亡途径被抑制的条件下,AMPK介导的内质网应激使肌肉嫩度在168 h提高了6.29%（P＜0.05）。因此,AMPK通过IRE1通路介导了内质网应激,进而促进了Caspase-3激活和牛肉嫩化。综上所述,牛肉宰后前期（0～12 h）,活化的AMPK通过加快糖酵解代谢促进了肌肉p H降低,导致Calpain-1自溶和活性下降,阻碍了肌肉嫩化。但在宰后12～168 h,AMPK通过激活细胞自噬、线粒体功能障碍诱导的细胞凋亡以及内质网应激,促进了Caspase-3激活和牛肉嫩化。因此,AMPK可以被作为一个改善牛肉嫩度的有效调控靶点。
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