肝衰竭是由于肝细胞大面积坏死而引发的临床综合症，它可以发生在处于代偿期的获得性或者遗传性肝脏疾病，在某一种或者几种急性诱因的作用下而发生的肝脏功能衰竭。简而言之，肝衰竭就是不可逆肝脏疾病的最终归宿。当今，肝脏移植已成为治疗终末期肝病最为有效的治疗手段。随着治疗例数的不断增加，供体来源短缺的现象日益突出。为了缓解这一矛盾，人们提出了各种对应措施，包括改进肝移植技术的部分肝脏移植，体外肝脏功能替代的“生物人工肝”支持治疗技术等。无论是哪一种治疗方式，其根本要解决的问题之一就是获得足够数量的具有肝细胞功能的细胞，并能让它们对受体发挥肝脏的各类功能。 近些年来，在生物人工肝的细胞来源问题上，来源于骨髓细胞的有功能的干细胞，逐渐受到人们的关注。通过一段时间的研究，人们发现通过建立恰当的体外诱导培养体系，可以促使骨髓干细胞转化为肝细胞，也就是骨髓来源的干细胞有可能成为生物人工肝和肝细胞移植的细胞来源。本研究的目的就是获取骨髓干细胞并在体外向肝细胞定向诱导后，再构建一个简单的“内置式”生物人工肝装置，最后移植到肝衰竭动物体内并且观察其治疗作用，以此来获得一个从干细胞的培养、定向诱导到体内移植、功能检测的试验研究平台，同时也可以为其他可能构建生物人工肝的细胞群提供一种检测其定向诱导后功能的较为实用的方法。 第一部分骨髓基质干细胞的获取、培养和鉴定 在本研究的第一部分中，我们获取骨髓单个核细胞，并采用贴壁培养法获得骨髓基质干细胞。在细胞培养过程中，观察细胞形态和数量的变化，采用流式细胞检测法，检测细胞表面抗原CD90.1、CD45。结果我们发现采用贴壁培养法来传代，同时去除每次传代时的悬浮未贴壁细胞，到第五代时，所得的贴壁细胞中骨髓基质干细胞的纯度可以达到85％以上。我们采用简单的小鼠细胞表面抗原CD90.1、CD45来正负检测，就可以基本鉴定出骨髓基质干细胞。其中骨髓基质干细胞阳性标志物CD90.1阳性的细胞占总检测细胞数的85.42％左右，而骨髓造血干细胞阳性标志物CD45阳性的细胞占总检测细胞数的5.0％左右。而小鼠骨髓基质干细胞是阴性表达CD45抗原，而能够阳性表达CD90.1抗原的，最终我们在第五代所得的细胞中骨髓基质干细胞能够占有85％比例以上，从而得到纯度较高的骨髓基质干细胞。 第二部分骨髓基质干细胞体外定向诱导为肝细胞样细胞 在第二部分的实验中，采用研究所前期工作总结的以FGF、HGF、OSM、EGF这四个细胞因子为主的细胞诱导培养体系来诱导所获得的骨髓基质干细胞，以此来获得具有部分肝细胞功能的细胞，我们称之为肝细胞样细胞。首先，肝脏的发生发展需要一系列的生理过程，在这过程中，多种生长因子和细胞因子参与了肝脏的发生发展。小鼠的胎肝形成发生于胚胎期第9天，通过前肠内胚层和心脏源性中胚层的相互作用而形成肝脏，在这过程中，FGF—4参与了内胚层向肝脏的转化。OSM，作为IL—6家族的成员，在胚胎发育的中晚期，对肝脏的发育成熟具有重要作用。HGF在胎儿出生后，肝脏的成熟过程中具有重要作用。其他细胞因子如EGF，TGF等在肝脏发育过程中也有重要作用。根据上述理论的研究和对本研究所前期实验工作的总结，我们选用了以FGF—4、HGF、OSM、EGF这四种细胞因子为主要诱导因子的细胞体系，来在体外培养、诱导骨髓基质干细胞向的肝细胞的转化。实验结果证实，以FGF—4、HGF、OSM、EGF作为诱导因子的诱导体系，可以将骨髓基质干细胞诱导为肝细胞样的细胞，而缺乏这些细胞因子的非诱导组中，我们未能见到肝细胞样细胞。在骨髓基质干细胞的诱导分化过程中，我们不仅在mRNA水平检测到AFP、ALB、TTR、CK18的表达，而且在细胞培养的第21天，可以检测到细胞内表达ALB和CK18蛋白。在细胞分化过程中，观察细胞形态和数量的变化，RT—PCR检测基因表达的变化，Westernblot和流式细胞技术在蛋白水平检测ALB和CKl8表达情况。从以上结果我们可以断定，我们建立的诱导体系是有效的。 第三部分小鼠肝衰竭模型的构建 而在第三部分实验中，我们采用倒千里光碱注射和保留右叶的肝脏大部切除术的方法建立小鼠的肝功能衰竭模型。通过检测小鼠术后肝脏功能，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、间接胆红素(HBil)、乳酸脱氢酶(LDH)等血清学指标，并切取术后7天存活小鼠的右叶肝脏组织进行光镜、电镜检测，我们可以确定使用倒千里光碱注射和保留右叶的肝脏大部切除术的方法建立小鼠的肝功能衰竭模型是能够提供一种有效的肝衰竭小动物实验模型。 第四部分定向诱导后的骨髓基质干细胞对肝衰竭小鼠的治疗作用 在第四部分实验中，在前面3部分实验的基础上，我们采用Millipore公司提供的扩散盒技术，将各组对应数量的细胞包入扩散盒内后，移植入第三部分构建的肝衰竭的小鼠腹腔内，从而建立一个简单的“内置式”生物人工肝模型。这样可以来检测体外骨髓基质干细胞诱导后能否对肝衰竭小鼠的肝脏功能提供一定的支持。我们通过观察小鼠术后生存情况，统计一周生存率和肝脏功能指标，观察肝脏病理变化，和对照组比较后，发现诱导后的骨髓基质干细胞能够对肝脏功能衰竭的小鼠发挥一定的改善肝脏功能的作用，也就是说，骨髓基质干细胞在FGF-4、HGF、OSM、EGF这四种细胞因子为主要诱导因子的细胞体系中诱导后，能够在动物体内，对肝功能衰竭的小鼠提供一定的肝脏功能支持治疗作用。