流行性感冒（influenza,简称流感）是流感病毒引起的一类发病急、易传变,具有流行性与传染性的急性呼吸道感染,其临床表现除严重的外感症状外,还可见周身酸痛、乏力等全身症状。数量巨大、种类繁多的肠道微生物构成了人体中最复杂的微生态系统。肠道菌群与宿主之间互利共生、相互依存,肠道菌群在调控新陈代谢的途径、维持免疫系统的发育和功能、维持机体的稳态等方面都发挥着重要的作用;而宿主肠道则为菌群提供富含营养、适宜的生存环境。然而,一旦宿主与菌群间互相维持的稳定平衡关系被打破,将有可能造成一系列的紊乱及病理生理反应,从而促进疾病的发生。有研究显示,肠道菌群不仅参与了流感病毒感染后肠道的免疫损伤,还能调控肺脏抗流感病毒的免疫应答,正常的肠道菌群在维持肺脏抗病毒免疫中具有至关重要的作用,肠道菌群失调的小鼠免疫应答受损。此外,相较于正常小鼠,感染了流感病毒的小鼠肠道菌群会发生变化。流感是由于六淫之邪、时行疫毒侵犯人体而导致的,属于中医外感温病的范畴;素体虚弱、正气不足、卫外不固亦是导致流感发生的重要原因。麻杏石甘汤是辛凉解表代表方,具有清热宣肺、辛凉平喘的功效,临床广泛用于流感、病毒性肺炎等肺系疾病的治疗。中医在治疗外感病时,注重祛邪与扶正兼顾。脾胃是后天之本、生气之源,脾胃运化正常则正气充沛、卫气抵御病邪有力,故脾胃的顾护尤其重要。临床部分流感患者可见精神不振、体弱懒言、无力气短等肺脾气虚症状,小鼠感染流感后,其乏力气喘、便秘或粪质稀薄等符合此证的表现,治宜健脾益气,使正气得养。四君子汤是益气健脾基础方,临床用于治疗以胃脾气虚为主的多种病症。在前期研究中,我们证实四君子汤对麻杏石甘汤治疗流感感染的小鼠具有显著的增效作用:四君子汤单独使用抗流感作用以及改善小鼠症状的作用效果并不明显,但与麻杏石甘汤合用治疗流感小鼠具有显著的疗效;麻杏石甘合四君子汤对流感小鼠的疗效优于单独使用麻杏石甘汤。现代研究证实四君子汤可改善脾虚小鼠肠道菌群失调、具有免疫调节作用。那么,四君子汤对麻杏石甘汤治疗流感小鼠的增效作用是否与其对肠道菌群的调节有关需进一步探讨。目的:基于肠道菌群在流感感染及抗流感免疫应答中的重要作用,和我们的前期研究基础,本研究进一步探讨四君子汤、麻杏石甘汤及两药合方对正常小鼠、流感感染小鼠肠道菌群、及流感感染小鼠肺组织T细胞、DC细胞亚群的影响。本研究通过Illumina Miseq高通量测序技术,检测麻杏石甘汤、四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤对正常小鼠肠道菌群的影响,明确药物是否能够对肠道菌群的结构及多样性产生直接的调节作用;建立流感病毒小鼠模型,明确流感感染以后小鼠的肠道菌群变化以及药物对流感感染小鼠肠道菌群结构及多样性的影响;建立流感病毒小鼠模型,流式细胞术检测流感感染小鼠肺组织中CD4+T、CD8+T细胞、CD11c+、CD103+DC的数量,以明确各药物对流感感染小鼠肺组织T细胞、DC细胞亚群的作用。方法:1.麻杏石甘汤、四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤对正常小鼠肠道菌群结构及多样性的影响设立正常组、麻杏石甘汤组（以下简称麻杏组）、四君子汤组（以下简称四君组）、麻杏石甘汤合四君子汤组（以下简称麻四组）,各组动物灌胃给药,0.15ml/次,2次/d,每组于第4、7天末次给药8h后分别在无菌环境下取小鼠粪便,Illumina Miseq高通量测序检测各组药物对正常小鼠肠道菌群的作用。2.麻杏石甘汤、四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤对流感感染小鼠肠道菌群结构及多样性的影响建立小鼠亚致死量流感病毒感染模型,设立正常组、病毒组、麻杏组、四君组、麻四组,各组动物灌胃给药,0.15ml/次,2次/d,每组于第4、7天末次给药8h后分别在无菌环境下取小鼠粪便,Illumina Miseq高通量测序检测各组药物对流感感染小鼠肠道菌群的作用。3.麻杏石甘汤、四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤对流感小鼠肺组织T细胞、DC细胞亚群的影响建立小鼠亚致死量流感病毒感染模型,设立正常组、病毒组、麻杏组、四君组、麻四组,各组动物灌胃给药,0.15ml/次,2次/d,每组于末次给药4h后取材,检测各组小鼠肺组织中CD4+T、CD8+T细胞、CD11c+、CD103+DC的数量,明确药物对流感小鼠肺组织T细胞、DC细胞亚群的影响。结果:1.麻杏石甘汤、四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤对正常小鼠肠道菌群结构及多样性的影响各组药物的使用会使小鼠的肠道菌群发生结构及比例的改变,在属分类学水平上,各给药组与正常组间有不同的菌属表现出差异:1.1服用四君子汤后,第4天:乳杆菌属、Alistipes占比下降,CandidatusArthromitus 分段丝状细菌、Roseburia、Tyzzerella3 显著减少,Eubacteriumventriosumgroup、Blautia、Anaerofustis、Erysipelatoclostridium 等显著增多;第7天:乳杆菌属占比升高,Alistipes占比下降,Eubacterium ventriosumgroup显著增多,RuminococcaceaeUCG009、LachnospiraceaeUCG001 显著减少。1.2服用麻杏石甘汤后,第4天:Alistipes占比升高,Peptococcaceaeguncultures、Coprococcus1粪球菌属1显著增多,乳杆菌属、分段丝状细菌显著减少;第7天:Alistipes 占比升高,Coprococcus1粪球菌属1、Oscillibacter 颤螺旋菌属、Roseburia显著增多。1.3服用麻杏石甘汤合四君子汤后,第4天:Alistipes占比下降,乳杆菌属、分段丝状细菌显著减少,Ruminococcaceaegunclassified显著增多;第7天:Alistipes占比下降,Bifidobacterium 双歧杆菌属、Eubacteriumventriosumgroup、Ruminococcaceaegunclassified 显著增多。2.麻杏石甘汤、四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤对流感感染小鼠肠道菌群结构及多样性的影响流感感染使小鼠的肠道菌群发生结构及比例的变化,引起菌群失调;各组药物的使用对流感小鼠失调的肠道菌群产生影响,在属分类学水平上,病毒组与正常组、各给药组与病毒组间有不同的菌属表现出差异:2.1感染流感病毒后的第4天:Tyzzerella显著增多,EubacteriumVentriosumgroup显著减少;第7天:Alistipes占比升高,分段丝状细菌、乳杆菌属、Anaerofustis、EubacteriumVentriosumgroup、RuminococcaceaeUCG014显著减少,Tyzzerella、Anaerotruncus、拟普雷沃菌属显著增多。2.2四君组在感染第4天:分段丝状细菌、Tyzzerella、norankfLachnospiraceae、norankfRuminococcaceae 显著减少,EubacteriumVentriosumgroup、RuminococcaceaeUCG002、RuminococcaceaeUCG014 显著增多;第 7 天:Akkermansia、脱硫弧菌属、Enterorhabdus、Eubacterium Ventriosumgroup、RuminococcaceaeUCG005、RuminococcaceaeUCG014 显著增多,颤螺旋菌属、Tyzzerella、norankfRuminococcaceae 显著减少,Alistipes 占比下降。2.3麻杏组在感染第4天:分段丝状细菌、脱硫弧菌属、颤螺旋菌属、Tyzzerella、Blautia、norankfLachnospiraceae、Anaerotruncus、RuminococcaceaeUCG009显著减少,EubacteriumVentriosumgroup 显著增加,Alistipes 占比升高;第 7 天:Anaerofu stis、RuminococcaceaeUCG014、RuminococcaceaeNK4A214group、Subdoligranulum 显著增多,norankfLachnospiraceae、unclassifiedfLachnospiraceae、Blautia显著减少。2.4 麻四组在感染第 4 天:Tyzzerella、RuminococcaceaeUCG009、Blautia、Butyricicoccus 显著减少,EubacteriumVentriosumgroup 显著增多;第 7 天:颤螺旋菌属、Tyzzerella、Anaerotruncus、Butyricicoccus、Blautia、norankfRuminococcaceae、LachnospiraceaeFCS020group 显著减少,RuminococcaceaeUCG014、Anaerofustis显著增多,Alistipes占比升高。3.麻杏石甘汤、四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤对流感小鼠肺组织T细胞、DC细胞亚群的影响3.1感染第7天,病毒组小鼠肺中CD4+T淋巴细胞占比较正常组显著降低（P＜0.01）,各给药组的CD4+T淋巴细胞占比较病毒组均有升高的趋势,但无统计学意义;病毒组小鼠肺中CD8+T淋巴细胞占比较正常组显著降低（P＜0.05）,四君组的CD8+T淋巴细胞占比较病毒组升高,麻杏组与麻四组较病毒组略微降低,但均无统计学意义。3.2感染第7天,病毒组小鼠肺中的CD11c+细胞较正常组显著增加（P＜0.05）,各给药组的CD11c+细胞数量较病毒组均减少,但无统计学意义;病毒组小鼠肺中的CD103+DC细胞较正常组升高,麻杏组的CD103+DC细胞数量较病毒组升高,四君组与麻四组较病毒组降低,但均无统计学意义。3.3感染第10天,病毒组小鼠肺中的CD11c+细胞较正常组显著增加（P＜0.05）,各给药物的CD11c+细胞较病毒组均增多,尤以麻四组最为显著（P＜0.01）;病毒组小鼠肺中的CD103+DC细胞较正常组显著升高（P＜0.001）,麻杏组与麻四组的CD103+DC细胞数量较病毒组显著升高（P＜0.001、P＜0.001）。结论:1.各中药经方均可以改变正常小鼠肠道菌群的构成及比例。四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤的使用会降低病原菌Alistipes的占比,且四君子汤与麻杏石甘汤的合用,使双歧杆菌这一益生菌的丰度显著增加。而麻杏石甘汤降低乳杆菌属等益生菌的含量,增加粪球菌属1、Alistipes等病原菌的含量,对正常小鼠肠道菌群的结构及多样性产生显著的影响。此外,四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤的使用会显著性地使与SCFA产生相关的菌属丰度增加。2.流感病毒的感染会使小鼠的病原菌Alistipes、Tyzzerella增加,益生菌分段丝状细菌、乳杆菌减少,与SCFAs产生相关的菌属减少,引起严重的失调。而四君子汤、麻杏石甘汤、麻杏石甘汤合四君子汤的使用会不同程度地改善流感引起的这种失调状态:四君子汤的使用,可以降低病原菌Alistipes、Tyzzerella等的含量、使益生菌Akkermansia增加;麻杏石甘汤的使用,会使病原菌脱硫弧菌属、颤螺旋菌属和Tyzzerella数量减少的同时引起病原菌Alistipes的增加,对流感小鼠的肠道菌群造成显著影响;麻杏石甘汤合四君子汤的使用,使病原菌Tyzzerella和颤螺旋菌属显著下降。此外,四君子汤与麻杏石甘汤单独使用的第4天,均会引起病毒小鼠肠道内的益生菌分段丝状细菌数量下降,而四君子汤与麻杏石甘汤的配合使用,抑制了分段丝状细菌减少与Alistipes增加的趋势。不管在正常小鼠还是在流感小鼠模型上,麻杏石甘汤的使用均会增加Alistipes的占比,说明清热类药物由于性味苦寒,可能对菌群有一定的“毒性”作用,在抑制某些益生菌的同时也会增加致病菌的占比,而配合如四君子汤等的补益类药物可以中和这种副作用。另外,各组药物的应用使与SCFAs产生相关的菌属发生复杂变化。3.在流感感染的适应性免疫应答期,随着用药时间的延长,四君子汤可以促进麻杏石甘汤增加DC细胞数量的作用,从而介导小鼠进一步的抗病毒细胞免疫应答。