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研究背景和目的:胆道恶性肿瘤（BTC）是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤,早期诊断困难,病情进展快,易侵犯邻近器官、发生淋巴转移和远处转移,大多数患者在明确诊断的时候已经处于晚期,失去了根治性切除的机会,导致总体预后不佳。以程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（ICIs）在多种恶性肿瘤的治疗中取得了良好效果。然而,晚期BTC患者对ICIs治疗的客观应答率（ORR）并不乐观,只有少数患者可以从中获益。因此,如何发现有效预测免疫治疗疗效的生物标志物、以便在治疗前精确筛选获益人群是BTC免疫治疗亟待解决的关键问题。本课题旨在评估PD-1抑制剂治疗晚期BTC的有效性和安全性,筛选可能预测PD-1抑制剂治疗获益的相关基因,以及通过研究这些基因对PD-L1表达和免疫细胞的影响来揭示这些基因在免疫治疗中潜在的作用。研究方法:第一部分:PD-1抑制剂治疗晚期BTC的疗效和预后因素分析回顾性分析我中心以PD-1抑制剂为基础进行系统治疗的92例晚期BTC患者临床资料,探讨不同治疗方案的疗效、可能影响预后的因素,以及不同类型BTC对PD-1抑制剂的应答效果。第二部分:晚期BTC中PD-1抑制剂疗效预测基因的筛查研究以第一部分中92例晚期BTC患者为研究对象,经过病理筛选及测序平台质控后,将符合标准的41例晚期BTC患者根据实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版,分为免疫治疗临床获益组（DCB）与非获益组（NCB）。通过Nanostring测序平台检测289个肿瘤免疫相关基因表达,筛选出两组间差异表达基因,进一步采用免疫组化方法验证差异表达基因在BTC肿瘤组织中的表达。第三部分:高表达S100A8对BTC PD-L1表达和免疫细胞活化的影响使用定量PCR（q PCR）分析S100A8和PD-L1在胆囊癌（GBC）和胆管癌（CC）细胞中的表达情况。使用细胞转染技术在GBC细胞中对S100A8进行过表达或者敲低,然后分析S100A8过表达或者敲低表达后对GBC细胞中PD-L1表达和免疫细胞活化的影响。通过LDH活性检测和IFN-γ浓度检测来分析肿瘤细胞特异性的CD8+细胞毒性T细胞（CTL）对不同S100A8表达的GBC细胞的杀伤作用以及PD-1抑制剂对其杀伤作用的影响。最后,使用体内实验评估肿瘤细胞特异性的CD8+CTL对不同S100A8表达的GBC细胞的杀伤作用。结果:第一部分:本组患者中肝内胆管癌（ICC）、肝外胆管癌（ECC）、GBC分别为34例、27例和31例。接受治疗6个月后,GBC和ICC组的ORR分别为25.8%和23.5%,优于ECC组（0%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。PD-1抑制剂联合靶向治疗组的中位无进展生存期（m PFS）和中位总生存期（m OS）分别为5.0个月和11.0个月,大于PD-1抑制剂单药组的2.5个月和7.5个月,差异有统计学意义（P=0.007和P=0.005）;PD-1抑制剂联合化疗组的m PFS及m OS与单药组和联合靶向治疗组相比,差异无统计学意义。第二部分:与NCB组相比,通过Nanostring测序平台共筛选出9个在DCB组高表达的基因（CTAG1B、CEACAM3、CXCL5、HLA-DQA2、CD19、S100A8、S100A9、G6PD、IL1β）和1个在DCB组低表达的基因（EGFR）。免疫组化实验证实S100A8在DCB组中高表达,差异有统计学意义（P＜0.01）,相关性分析提示S100A8表达与PD-L1的表达呈正相关（r=0.577,P＜0.01）。第三部分:S100A8和PD-L1在GBC细胞株和CC细胞株中都显著高表达,在GBC细胞中,过表达S100A8可以促进PD-L1的表达,而敲低S100A8表达后有相反的效果。敲低S100A8表达可以显著刺激CD8+T细胞活化,而过表达S100A8则对CD8+T细胞的活化有显著抑制作用。加入PD-1封闭抗体后,肿瘤细胞特异性的CD8+CTL对GBC细胞的杀伤作用均增强,且对过表达S100A8的GBC细胞杀伤作用的增强趋势更为明显。体内实验证实,和S100A8低表达的GBC细胞相比,S100A8高表达的GBC细胞能够抑制CD8+CTL的杀伤作用。结论:1、PD-1抑制剂联合靶向治疗对于晚期BTC患者的疗效优于PD-1抑制剂单药;与ECC患者相比,GBC和ICC患者接受以PD-1抑制剂为基础的系统治疗后,获益可能更大。2、相比NCB组,S100A8在DCB组肿瘤组织中表达明显升高,并且与PD-L1表达呈正相关,提示S100A8高表达的BTC患者可能从PD-1抑制剂治疗中获益。3、S100A8在BTC细胞中显著高表达,S100A8可以通过促进PD-L1表达和抑制CD8+T细胞活化,促使BTC免疫逃逸。4、S100A8有潜力成为BTC免疫治疗疗效预测的标志物或肿瘤治疗的新靶点。