临床上,糖皮质激素主要用来控制一些急性、重症炎症和减少自身免疫性疾病炎性细胞的侵袭,如系统性红斑狼疮、肾病综合征、血液系统疾病和急性重症呼吸道炎性疾病,包括2003年的非典型性肺炎和最近流行的新型冠状病毒性肺炎。由于原发病的原因,需要长期大剂量糖皮质激素的使用,最终出现股骨头坏死,称之为激素性股骨头坏死。患者多表现为髋关节疼痛难忍、行走障碍和活动受限,这类患者在非创伤性股骨头坏死的患者中占比最高。目前激素性股骨头坏死患者发病趋于年轻化,致残率较高,随病情的进展最终需行髋关节置换术,造成极大的社会经济负担和病人的困扰。激素性股骨头坏死是长期大剂量使用糖皮质激素所导致的严重并发症之一。激素性股骨头坏死的发病机制很复杂,但都不完全明确,存在众多假设和学说,如成骨细胞凋亡、成骨成脂分化失衡、氧化应激、凝血功能紊乱和脂肪栓塞等。其中,成骨细胞凋亡、成骨成脂分化失衡和氧化应激等学说的研究比较常见,都是直接造成股骨头组织内成骨细胞数量减少,骨修复速度不足以补偿成骨细胞减少的速度,继而出现骨质疏松,从而不可避免地导致股骨头坏死。间充质干细胞是一类多功能细胞,能分化成多种细胞,还可以旁分泌一些细胞因子调节免疫、促进修复、抗凋亡等。这些特性使得干细胞在股骨头坏死的研究中脱颖而出。已有大量的研究表明干细胞能有效治疗股骨头坏死。这些研究中,最常用的方式是髓芯减压结合自体骨髓间充质干细胞移植,虽然在骨髓间充质干细胞方面有所改进,如体外扩增,结合支架和细胞因子的植入,但都没有达到理想的效果。间充质干细胞（MSCs）广泛分布在身体的结缔组织中,可以从骨髓、脂肪、滑膜、脐带等结缔组织中提取。其中骨髓来源的间充质干细胞的研究最为广泛,被认为在软骨修复和改善髋部症状方面效果最佳。但是骨髓间充质干细胞的分化能力随着扩增次数的增加而降低,收集细胞的操作也是有创的,还会导致供体部位的疼痛。人脐带间充质干细胞则具有极强的优越性,可经无创途径收集,免疫原性较低。最重要的是,h UC-MSCs具有非常高的细胞增殖潜力和较强的成骨能力。目前人脐带间充质干细胞在激素性股骨头坏死领域研究较少,治疗机制的研究也非常少。本研究通过体内研究,即建立大鼠早期激素性股骨头坏死的模型,同时尾静脉注射人脐带间充质干细胞进行防治和体外研究,即利用地塞米松建立成骨细胞凋亡的模型,再用h UC-MSCs与成骨细胞进行共培养,探讨h UC-MSCs在防治早期激素性股骨头坏死的疗效及其潜在机制。第一部分人脐带间充质干细胞防治大鼠早期激素性股骨头坏死的研究目的:研究人脐带间充质干细胞对大鼠激素性股骨头坏死的防治作用及其潜在机制。方法:将48只SD大鼠随机分为4组:对照组、模型组、高剂量治疗组（h UC-MSCs106）和低剂量治疗组（h UC-MSCs 5×105）。利用脂多糖及甲强龙构建大鼠激素性股骨头坏死的模型。6周后采血并分离股骨头组织,利用血清学检测血清中碱性磷酸酶（ALP）的活性和甘油三酯（TG）的含量,通过HE染色判定股骨头坏死的发生率及评估股骨头组织空骨陷窝率,TUNEL染色检测股骨头组织中细胞凋亡的情况,Micro-CT评价股骨头组织骨密度情况,以及骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁间隙（Tb.Sp）,Western blot和q RT-PCR检测组织中bcl-2、bax、Caspase-3、RUNX2、ColⅠ、PPARγ蛋白及m RNA表达水平。结果:对照组、模型组、低剂量治疗组和高剂量治疗组股骨头坏死的发生率分别为0（0/12）,83%（10/12）,50%（6/12）和17%（2/12）,模型组的空骨陷窝率和TUNEL阳性细胞率较对照组显著升高,人脐带间充质干细胞干预治疗后上述情况显著改善,血清学检测中,治疗组ALP的活性显著高于模型组,TG的含量显著低于模型组,高剂量组较低剂量治疗组效果更加明显。Micro-CT显示治疗组中骨小梁排列紧密,BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著高于模型组,Tb.Sp显著低于模型组,提示治疗组骨密度显著高于模型组,高剂量较低剂量治疗组效果更加明显。Western blot和q RT-PCR的检测中,模型组bcl-2、RUNX2、ColⅠ蛋白及m RNA显著低于对照组,bax、Caspase-3、PPARγ蛋白及m RNA显著高于对照组,经人脐带间充质干细胞干预后明显逆转了这些改变。结论:人脐带间充质干细胞可能通过调控bcl-2,bax,Caspase-3和RUNX2、ColⅠ、PPARγ的表达,抑制成骨细胞凋亡,促进成骨抑制成脂防治大鼠早期激素型股骨头坏死。第二部分人脐带间充质干细胞共培养对地塞米松诱导成骨细胞凋亡的影响目的:研究不同浓度人脐带间充质干细胞对糖皮质激素诱导小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1凋亡的影响。方法:将不同浓度的人脐带间充质干细胞与小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1进行非接触式Transwell共培养,分组如下:A组:空白组,成骨细胞;B组:对照组,成骨细胞+地塞米松;C组:0.1:1共培养组,人脐带间充质干细胞:成骨细胞（0.1:1）+地塞米松;D组:0.5:1共培养组,人脐带间充质干细胞:成骨细胞（0.5:1）+地塞米松;E组:1:1共培养组,人脐带间充质干细胞:成骨细胞（1:1）+地塞米松;F组:10:1共培养组,人脐带间充质干细胞:成骨细胞（10:1）+地塞米松;G组:100:1共培养组,人脐带间充质干细胞:成骨细胞（100:1）+地塞米松。利用CCK8检测各组MC3T3-E1的存活率,流式细胞术检测各组MC3T3-E1的凋亡情况,并筛选出最佳治疗组。结果:CCK8检测结果显示地塞米松能降低成骨细胞存活率,人脐带间充质干细胞能提高成骨细胞存活率,存活率随着浓度的增高而增高。其中F组:人脐带间充质干细胞:成骨细胞（10:1）浓度组效果最佳,存活率为66.047±0.028%。流式细胞术检测结果显示地塞米松能诱导成骨细胞凋亡,人脐带间充质干细胞能减少成骨细胞凋亡,凋亡率随浓度的增高而降低。其中F组:人脐带间充质干细胞:成骨细胞（10:1）浓度组效果最佳,凋亡率为27.43±1.98%。结论:人脐带间充质干细胞能有效降低地塞米松诱导的成骨细胞凋亡,人脐带间充质干细胞可能通过旁分泌的形式改善地塞米松对成骨细胞的损害。第三部分人脐带间充质干细胞通过Nrf2-ARE信号通路降低糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡的研究目的:研究人脐带间充质干细胞通过Nrf2-ARE信号通路对地塞米松诱导的成骨细胞凋亡的保护作用。方法:将人脐带间充质干细胞与小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1以10:1的比例进行非接触式Transwell共培养,分组如下:空白组（成骨细胞）、对照组（成骨细胞+地塞米松）、抑制剂组（成骨细胞+地塞米松+抑制剂ML385）、共培养组（成骨细胞+地塞米松+人脐带间充质干细胞）、共培养+抑制剂组（成骨细胞+地塞米松+人脐带间充质干细胞+抑制剂ML385）。利用CCK8检测各组成骨细胞的存活率;流式细胞术检测各组成骨细胞的凋亡及细胞内ROS的水平情况;利用生化分析细胞内超氧化物歧化酶（SOD）,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）三种酶的活力情况;利用蛋白印迹法（Western blot）分析核因子E2相关转录因子2（Nrf2）及其下游蛋白（血红素氧合酶-1 HO-1、NADPH醌氧化还原酶1 NQO1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基GCLC、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基GCLM）和凋亡相关蛋白（B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白bax、B细胞淋巴瘤/白血病-2 bcl-2、活化的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3、9 cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、细胞色素C Cytochrome C蛋白）表达水平。结果:CCK8结果显示地塞米松能显著降低成骨细胞的存活率,加入ML385存活率进一步的降低。与对照组比较,人脐带间充质干细胞共培养能显著提高成骨细胞存活率,加入ML385成骨细胞的存活率显著降低。流式细胞术检测中,地塞米松能诱导成骨细胞凋亡,提高成骨细胞ROS水平,加入ML385成骨细胞凋亡进一步的增加,ROS水平进一步的升高。与对照组比较,人脐带间充质干细胞共培养能显著减少成骨细胞凋亡,降低ROS水平,加入ML385成骨细胞凋亡率显著增加,ROS水平显著升高。生化检测结果显示地塞米松能降低抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT的活性,加入ML385抗氧化酶的活性进一步降低。与对照组比较,人脐带间充质干细胞共培养能显著提高抗氧化酶活性,加入ML385抗氧化酶的活性显著降低。Western blot检测结果中,地塞米松能降低抗氧化蛋白Nrf2及其下游蛋白HO-1、NQO1、GCLC、GCLM的表达,降低bcl-2蛋白的表达,提高bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Cytochrome C蛋白的表达。加入ML385,抗氧化蛋白及bcl-2蛋白的表达进一步的降低,bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Cytochrome C蛋白的表达进一步的升高。与对照组比较,人脐带间充质干细胞共培养能显著提高抗氧化蛋白及bcl-2蛋白的表达,降低bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Cytochrome C蛋白的表达。共培养体系中加入ML385,抗氧化蛋白及bcl-2蛋白的表达显著降低,bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Cytochrome C蛋白的表达显著升高。结论:1.地塞米松能提高成骨细胞的氧化应激水平导致成骨细胞凋亡;2.人脐带间充质干细胞能通过Nrf2-ARE信号通路减少糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡。全文总结:1.h UC-MSCs通过抑制成骨细胞凋亡,促进成骨、抑制成脂从而减少大鼠早期激素性股骨头坏死的发生率。2.h UC-MSCs与成骨细胞共培养能减少糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡。3.h UC-MSCs通过Nfr2信号通路减少地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。