【摘 要】
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土臭素(GSM)是富营养化水体中过度生长的放线菌、蓝绿藻的代谢产物,土腥味浓烈,且易被水体中水生生物吸附,使其产生难闻气味。人的嗅觉对GSM极其敏感,使得即使它在水中的含量极低也能被察觉。我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)对GSM的允许限值均为10 ng·L-1。为了保障水质安全及人们的身体健康,迫切需要建立灵敏度高、选择性强、快速、简便的测定检测水样及水产品中痕量GSM的分析方
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土臭素(GSM)是富营养化水体中过度生长的放线菌、蓝绿藻的代谢产物,土腥味浓烈,且易被水体中水生生物吸附,使其产生难闻气味。人的嗅觉对GSM极其敏感,使得即使它在水中的含量极低也能被察觉。我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)对GSM的允许限值均为10 ng·L-1。为了保障水质安全及人们的身体健康,迫切需要建立灵敏度高、选择性强、快速、简便的测定检测水样及水产品中痕量GSM的分析方法。目前,检测GSM的主要方法为气相色谱-质谱联用仪法。由于GSM在样品中含量极低,样品需先经固相萃取法或固相微萃取法等分离、萃取。但上述方法存在仪器昂贵、操作复杂、检测费用高、不能用于现场快速检测等缺点。免疫分析是建立在抗原与抗体之间特异性反应基础上的分析方法。目前,在临床、生物、食品和环境分析领域中广泛应用的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、简便、快速、可同时检测大量样品的优点。建立免疫分析方法的先决条件是获得针对待测物的特异性结合的抗体。大分子化合物如蛋白质等可以直接作为免疫原免疫动物产生抗体。然而,分子量小于1000Da的小分子化合物(通常被称为半抗原)不具有免疫原性,不能直接免疫动物产生抗体;利用半抗原上的羧基等活性基团(自身存在或修饰得到)与载体蛋白(如牛血清白蛋白)制备成免疫原免疫动物能够获得与待测物相结合的抗体。其中活性基团修饰的原则:得到的新半抗原应尽量保持本有的分子特征结构。GSM的分子量仅为182,结构简单。GSM含有羟基,似乎可通过丁二酸酐活化法,使羟基酯化从而使GSM带上羧基。但存在GSM价格昂贵(约¥1000·μg-1),修饰成本过高的问题。同时羟基位阻过大,修饰困难。不仅如此,羟基的丢失极有可能大幅降低抗体的特异性。曾有学者通过价格便宜的2-甲基环己酮为起始物合成了 GSM半抗原修饰物。但由于所合成的修饰物结构与GSM的原有分子结构相差较大,因此产生的抗体的灵敏度低、特异性差。为了获得高灵敏度和高特异性的抗GSM抗体,本文的主要研究工作是:①设计并合成多种GSM半抗原修饰物;②通过活性基团(主要是羧基)与载体蛋白相连,制得免疫原和包被抗原;③以免疫原免疫小鼠,得到多种鼠抗GSM的多克隆抗体;④将包被抗原用于间接竞争ELISA(ic-ELISA)并对抗体的性能进行考察,研究GSM半抗原修饰物分子结构对抗体性能的影响。具体如下:①在半抗原合成上,创造了一种新的方法,即亲核取代——分子内成环串联反应代替曾经的替罗宾森环化法,在获得GSM骨架的同时构建GSM半抗原所需的官能团,减少了合成步骤和风险。②在半抗原结构上,通过不同的合成路线,合成了羟基保留、羟基邻位甲基保留或者不保留的GSM修饰半抗原、其中存在不同结构变化的连接臂。③在免疫原的制备与动物实验上,合成了五种免疫原偶联BSA并免疫动物。④在评估抗体性能上,合成了四种包被抗原支撑ic-ELISA评估抗体与GSM的结合能力和特异性。以在一定条件下免疫原P-B4获得的血清血清为多克隆抗体,以P-C3作为包被抗原,初步构建ic-ELISA分析方法,并得到GSM(±)的检测限为42 pg·mL-1。
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