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1 实验目的研究经典古方在体内、体外实验中通过肿瘤相关巨噬细胞对人胃癌MGC-803细胞增殖及皮下移植瘤的影响。2 实验方法2.1体外实验具体研究方法如下:①检测经典古方对人胃癌MGC-803细胞毒性及增殖抑制作用;②PMA诱导人白血病细胞THP-1和人淋巴瘤细胞U937向巨噬细胞分化,并用LPS和IL-4分别激活为M1型和M2型巨噬细胞,再用ELISA检测不同表型巨噬细胞IL-10和IL-12p70分泌情况;③将不同表型的巨噬细胞和MGC-803细胞共培养,检测其对MGC-803细胞的影响;④检测经典古方对巨噬细胞表型的影响。2.2体内实验具体研究方法如下:①建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型;②将造模一周后的裸鼠分为三批,每批分为对照组、中药低剂量组和中药高剂量组三组,三批分别给予大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸灌胃,连续灌胃28天,期间测量裸鼠体重及皮下移植瘤瘤径;③裸鼠麻醉后取材,测量瘤重及肿瘤长径和短径,计算抑瘤率;④通过免疫组化法检测肿瘤组织及瘤旁组织中 HIF-1α、IL-4、IL-10、IL-12、MCP-1、TGF-β1、TNF-α 的表达;⑤通过Western Blot检测肿瘤组织中Arg-1和iNOS的表达。3 结果3.1体外实验体外实验证明:①经典古方对MGC-803细胞均有毒性作用,大黄黄连泻心汤浓度≤50μg/ml,附子理中丸≤1000μg/ml,六神丸≤100ng/ml,48h后细胞存活率仍＞80%;②经典古方排除毒性作用对MGC-803细胞的增殖均有抑制作用,大黄黄连泻心汤浓度≥10μg/ml,附子理中丸800～1000μg/ml有效,六神丸为100ng/ml有效;③M1型巨噬细胞较高表达IL-12p70、低表达IL-10,M2型巨噬细胞较低表达IL-12p70、高表达IL-10,Mφ型巨噬细胞介于两者之间,更倾向于M1型巨噬细胞;④M1型巨噬细胞抑制MGC-803细胞增殖,M2型巨噬细胞促进MGC-803细胞增殖,Mφ型巨噬细胞更倾向于M1型巨噬细胞,对MGC-803细胞增殖有轻度抑制作用;⑤经典古方对巨噬细胞表型有一定影响,大黄黄连泻心汤促进不同表型的巨噬细胞分泌IL-10,抑制其分泌IL-12p70,六神丸与之作用相反,附子理中丸促进Mφ、M1型巨噬细胞分泌IL-10,抑制其分泌IL-12p70,但对M2型巨噬细胞作用相反。3.2动物实验体内实验证明:①裸鼠一般情况随肿瘤负荷加重而变差,各批对照组在第10天出现精神不振,14天部分有脱肛现象,大黄黄连泻心汤、附子理中丸各剂量组与对照组基本一致,大黄黄连泻心汤初期可致裸鼠饮食减少、反应、活动降低,后可恢复,六神丸各剂量组裸鼠无明显精神不振现象,且裸鼠反应性、活动度增加;②各组裸鼠体重、皮下移植瘤体积稳步增加,期间存在上下波动,但差异无统计学意义（P＞0.05）;③按照大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸三批、每批按照低剂量组、高剂量组的顺序,各组抑瘤率分别为-9.20%、-13.83%、30.54%、5.84%、12.96%、55.77%,仅附子理中丸低剂量组和六神丸高剂量组与其对应对照组间瘤重的差异有统计学意义（P＜0.05）;④按照大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸三批、每批按照对照组、低剂量组、高剂量组的顺序,在各组肿瘤组织中HIF-1α的阳性表达率分别为80.2%、69.3%、65.4%、75.6%、96.5%、98.8%、78.4%、60.3%、64.2%,与各批对照组相比,各中药剂量组的差异均有统计学意义（P＜0.01）;IL-4 的阳性表达率分别为 63.24、63.7%、69.1%、67.7%、46.7%、41.1%、60.2%、46.0%、40.1%,与各批对照组相比,大黄黄连泻心汤高剂量组、附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.01）;IL-10的阳性表达率分别为76.3%、75.3%、76.5%、74.1%、75.9%、78.4%、78.7%、49.6%、51.9%,与各批对照组相比,六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.01）;IL-12的阳性表达率分别为68.7%、68.4%、73.8%、62.2%、73.1%、78.4%、71.0%、80.4%、80.1%,与各批对照组相比,大黄黄连泻心汤高剂量组、附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）;MCP-1 的阳性表达率分别为 55.1%、56.9%、57.1%、54.6%、53.4%、53.2%、52.8%、70.2%、79.8%,与各批对照组相比,六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.01）;TGF-β1 的阳性表达率分别为 52.0%、60.9%、69.4%、50.0%、51.4%、56.4%、51.3%、34.4%、30.3%,与各批对照组相比,附子理中丸高剂量组（P＜0.05）、大黄黄连泻心汤、六神丸各剂量组（P＜0.01）的差异有统计学意义;TNF-α的阳性表达率分别为64.2%、63.9%、63.6%、60.9%、73.5%、76.2%、61.2%、65.8%、69.6%,与各批对照组相比,附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）;⑤按照大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸三批、每批按照对照组、低剂量组、高剂量组的顺序,在各组瘤旁组织中 HIF-1α 的阳性表达率分别为 69.6%、58.4%、37.0%、70.1%、61.5%、36.2%、71.3%、65.5%、75.8%,与各批对照组相比,大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）;IL-4的阳性表达率分别为34.5%、24.4%、20.1%、35.3%、22.2%、25.1%、32.3%、23.7%、25.4%,与各批对照组相比,各中药剂量组的差异均有统计学意义（P＜0.01）;IL-10 的阳性表达率分别为 47.0%、50.5%、42.9%、45.5%、31.4%、35.9%、43.5%、28.7%、29.7%,与各批对照组相比,附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.01）;IL-12的阳性表达率分别为38.3%、34.8%、35.8%、35.5%、31.5%、35.8%、41.7%、39.2%、54.2%,与各批对照组相比,六神丸高剂量组的差异有统计学意义（P＜0.01）;MCP-1 的阳性表达率分别为 37.2%、36.3%、42.9%、33.4%、43.5%、49.7%、40.9%、54.2%、53.9%,与各批对照组相比,大黄黄连泻心汤高剂量组、附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.01）;TGF-β1的阳性表达率分别为53.7%、43.8%、33.7%、58.2%、57.9%、53.1%、52.9%、43.3%、44.0%,与各批对照组相比,附子理中丸高剂量组、大黄黄连泻心汤、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）;TNF-α的阳性表达率分别为 29.3%、29.8%、27.3%、31.8%、41.3%、48.6%、36.0%、41.1%、50.5%,与各批对照组相比,附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05）;⑥大黄黄连泻心汤实验中肿瘤组织中Arg-1的表达高于对照组,附子理中丸、六神丸肿瘤组织中Arg-1的表达低于对照组,六神丸肿瘤组织中iNOS的表达高于对照组。4结论综合实验结果,可以得出以下结论:①经典古方对MGC-803细胞均有毒性作用,且作用强度六神丸＞大黄黄连泻心汤＞附子理中丸;②排除毒性作用经典古方对MGC-803细胞的增殖均有抑制作用,大黄黄连泻心汤和附子理中丸安全性较大;③M1型巨噬细胞抑制MGC-803细胞增殖,M2型巨噬细胞促进MGC-803细胞增殖,Mφ型巨噬细胞更倾向于M1型巨噬细胞,对MGC-803细胞增殖有轻度抑制作用;④在体外实验中,大黄黄连泻心汤促进M2型巨噬细胞、抑制M1型巨噬细胞表达,六神丸与之作用相反,附子理中丸同时抑制M1、M2型巨噬细胞的表达;⑤大黄黄连泻心汤、附子理中丸不能有效减轻肿瘤负荷;六神丸则有一定减轻肿瘤负荷的作用,且能兴奋中枢神经,提高裸鼠反应性及活动度;⑥附子理中丸对裸鼠无明显毒性作用;大黄黄连泻心汤、六神丸对裸鼠有一定毒性作用,但作用不明显;⑦大黄黄连泻心汤对胃癌皮下移植瘤无抑制作用,甚至可能有一定促进作用;附子理中丸、六神丸对胃癌皮下移植瘤有抑制作用,且附子理中丸低剂量抑制效果较明显,而六神丸对其抑制作用与剂量呈正相关;⑧大黄黄连泻心汤促进肿瘤组织中M2型巨噬细胞的表达,在瘤旁组织中则抑制M2型巨噬细胞的表达;附子理中丸和六神丸在肿瘤组织和瘤旁组织中均能促进M1型巨噬细胞的表达,抑制M2型巨噬细胞的表达,且附子理中丸在肿瘤组织中的该作用更强,而六神丸在瘤旁组织中的该作用更强;⑨经典古方对胃癌皮下移植瘤的不同抑制作用可能与其对于巨噬细胞表型的影响有关。