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心肌梗死(MI)是心血管疾病中导致死亡的主要原因,心肌梗死后持续心肌缺血导致心肌细胞凋亡及心肌肥厚,从而触发一系列炎症及免疫反应,导致心肌病理重构、心力衰竭及猝死,心肌细胞凋亡被认为是心肌梗死(MI)后心脏重构的主要原因之一。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类以共价键形成环状结构的内源性非编码RNA,是一种重要的表观遗传调控方式,参与多种心血管疾病的发生发展过程。大量研究发现,circRNA在多种生物学功能中起着关键作用。然而,circ_0068655在心肌梗死和人诱导的多功能干细胞源性心肌细胞(HCMs)的作用尚不清楚。故本研究应用成年大鼠心肌梗死模型,观察心肌梗死细胞中circ_0068655的表达,并通过在HCMs中过表达及下调circ_0068655,检测其对心肌细胞状态及功能的影响,重点研究对心肌细胞凋亡的影响,并初步探讨circ_0068655调控心肌细胞功能的潜在机制。第一部分Circ_0068655促进缺氧所致心肌细胞损伤目的:观察缺氧损伤的HCMs中的circ_0068655、miR-498及PAWR的表达,探讨circ_0068655与缺氧所致心肌细胞凋亡的相关性。方法:1.构建成年SD大鼠在体心肌梗死动物模型,取梗死心肌组织,通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)的方法检测circ_0068655、miR-498及PAWR的表达。2.将HCMs在低氧细胞培养箱内分别培养3,6和12小时,采用qRT-PCR方法检测培养3小时,6小时和12小时HCMs的circ_0068655、miR-498及PAWR表达水平。采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)检测PAWR蛋白水平。3.应用RNA干扰技术shRNA构建circ_0068655基因沉默的HCMs,并将该细胞置于低氧细胞培养箱内培养12小时,采用MTT比色法观察心肌细胞活性,利用荧光分光光度计分析法检测Capspase-3活性,采用ELISA法检测细胞凋亡,运用Trans-well技术检测缺氧处理后心肌细胞的迁移能力及侵袭能力,从而来观察circ_0068655对缺氧HCMs的影响。结果:1.应用qRT-PCR检测心肌梗死大鼠心肌组织的circ_0068655、miR-498及PAWR的表达,结果显示,心肌梗死心肌组织中circ_0068655及PAWR的表达较对照组明显增高,(P<0.05),而miR-498与对照组相比明显降低,差别有统计学意义。Western blot结果表明,PAWR的蛋白表达较对照组明显增加,差别有统计学意义(P<0.05)。2.应用qRT-PCR检测HCMs中circ_0068655、miR-498及PAWR的表达,结果显示,低氧培养HCMs 3、6、12小时后,circ_0068655及PAWR表达较常氧培养下明显升高(P<0.05),而miR-498明显降低,并且呈时间依赖性。Western blot结果表明,PAWR的蛋白表达增加,并呈现时间依赖性(P<0.05)。3.qRT-PCR结果表明,转染沉默circ_0068655质粒sh-circ_0068655后HCMs的circ_0068655的表达明显降低(P<0.01),MTT比色法显示,缺氧状态下心肌细胞活力显著下降(P<0.01),转染sh-circ_0068655后,使缺氧所致心肌细胞活力下降程度较前恢复(P<0.01);荧光分光光度计分析法检测Capspase-3活性表明,转染sh-circ_0068655的HCMs对缺氧所致Capspase-3活性升高的程度得到缓解,ELISA法检测细胞死亡结果表明,sh-circ_0068655转染组与未转染组相比,死亡细胞明显下降(P<0.01),Trans-well试验结果显示,sh-circ_0068655转染组的细胞迁移及侵袭能力明显高于对照组(P<0.01)。结论:1.circ_0068655及PAWR在心肌梗死心肌组织中表达增加,而miR-498的表达降低。2.circ_0068655及PAWR在缺氧HCMs中表达增加,而miR-498的表达降低。并且circ_0068655及PAWR在缺氧HCMs中的表达随缺氧时间的延长而增加,而miR-498的表达却呈现相反现象。3.沉默circ_0068655的表达可改善缺氧所致心肌细胞凋亡,故circ_0068655可促进缺氧诱导的心肌细胞凋亡。第二部分Circ_0068655通过sponge miR-498促进心肌细胞凋亡目的:利用体外实验观察miR-498的表达对circ_0068655表达的影响,采用双荧光素酶实验确认circ_0068655含有miR-498识别和结合位点,以探讨circ_0068655通过sponge miR-498促进缺氧心肌细胞凋亡。方法:1.Circ_0068655定位:采用细胞质核分离法分离细胞质及细胞核的RNA,并采用qRT-PCR检测细胞质及细胞核中circ_0068655的表达。2.生物信息学分析:利用Circular RNA Interactome数据库预测circ_0068655序列中miR-498的结合位点。3.利用双荧光素酶报告基因检测验证circ_0068655与miR-498是否存在互补结合关系。构建含有miR-498结合位点序列的野生型和突变型双荧光报告载体psi CHECK-2-circ_0068655WT和psi CHECK-2-circ_0068655MT,分别与miR-498模拟物(miR-498mimic)及阴性对照(miR-NC)共转染于HCMs和HEK-293T细胞,观察各组荧光素酶活性,以确认circ_0068655区域含有miR-498识别和结合位点。4.Circ_0068655对miR-498的调节:构建circ_0068655过表达载体(PL-CDH-ci R-circ_0068655),将circ_0068655过表达载体PLCDH-ci Rcirc_0068655和circ_0068655沉默载体(sh-circ_0068655)转染HCMs后,采用qRT-PCR方法检测miR-498的表达水平。结果:1.qRT-PCR结果表明,circ_0068655在HCMs细胞质的表达明显高于细胞核,circ_0068655转录本位于细胞质内。2.双荧光素酶报告基因实验显示与对照组相比,转染了野生型circ_0068655报告载体和miR-498mimic的荧光素酶活性显著降低(P<0.01);而共转染突变型circ_0068655和miR-498mimic组与对照组相比荧光素酶活性无显著性差异,结果表明circ_0068655与miR-498可互补结合。3.QRT-PCR结果表明,转染circ_0068655过表达质粒PLCDHci R-circ_0068655抑制了HCMs的miR-498的表达,而转染沉默circ_0068655质粒sh-circ_0068655后,miR-498的表达增强(P<0.01)。结论:1.Circ_0068655转录本位于细胞质内。2.Circ_0068655可与miR-498直接结合,miR-498是circ_0068655作用的靶基因。3.Circ_0068655可负向调节miR-498的表达。第三部分Circ_0068655作为竞争性内源性RNA促进PAWR表达目的:利用体外实验观察miR-498对其潜在靶分子PAWR表达的调控作用,以探讨circ_0068655参与缺氧诱导的心肌细胞凋亡的下游作用机制。方法:1.生物信息学分析:利用Targetscan数据库对miR-498的靶基因进行预测。2.细胞转染:miR-498模拟物(miR-498mimic)、miR-498抑制剂(miR-498-inhibitor)及相应对照物利用pofectamine 2000试剂盒转染HCMs,采用qRT-PCR验证miR-498mimic和miR-498inhibitor的转染效果。3.利用双荧光素酶报告基因检测验证miR-498与PAWR的3’UTR是否存在互补结合关系。我们构建PAWR野生型及突变型的双荧光报告基因PAWR 3’UTR-WT和PAWR 3’UTR-MT,分别与miR-498mimic以及其阴性对照(miR-NC)共转染HCMs和HEK-293T细胞,观察各组荧光素酶活性的变化,从而确认miR-498与其靶基因PAWR 3’UTR的结合位点相结合。4.miR-498的靶基因的验证:运用生物素化标记RNA-pull down技术验证miR-498可与circ_0068655及PAWR 3’UTR相结合。5.miR-498对PAWR的调节作用:采用qRT-PCR观察miR-498及其抑制剂对PAWR表达的调控作用及运用Western blot分析检测PAWR蛋白的表达水平。6.circ_0068655对PAWR的调节作用:通过转染过表达(PLCDHci R-circ_0068655)/敲低circ_0068655(sh-circ_0068655)利用qRT-PCR及Western blot分析其对PAWR的表达的调控作用。结果:1.Targetscan预测显示PAWR 3’UTR有miR-498的结合位点。2.双荧光素酶报告基因实验显示与对照组相比,转染了野生型PAWR 3’UTR-WT报告载体和miR-498mimic的荧光素酶活性显著降低(P<0.01);而共转染突变型PAWR 3’UTR-MT和miR-498mimic组与对照组相比荧光素酶活性无显著性差异,结果表明PAWR与miR-498可互补结合。3.生物素化标记RNA-pull down试验显示,circ_0068655和PAWR都被生物素标记miR-498拉下。4.qRT-PCR结果显示,与对照组相比,miR-498mimic转染HCMs后miR-498的表达明显增加,而HCMs中PAWR的表达明显降低;与对照相比,miR-498抑制剂转染HCMs细胞后,miR-498的表达明显降低(P<0.01),但是,HCMs细胞中的PAWR水平显著升高。Western blot结果表明,与对照相比,miR-498抑制剂转染HCMs细胞后,PAWR翻译蛋白水平显著升高(P<0.01)。5 qRT-PCR结果表明,转染circ_0068655过表达质粒PLCDHci R-circ_0068655促进HCMs的PAWR的表达,而转染sh-circ_0068655沉默circ_0068655表达后,抑制了PAWR的表达(P<0.01)。结论:1.miR-498直接结合PAWR序列的3’UTR。2.miR-498存在circ_0068655和PAWR的结合位点。3.miR-498负向调节心肌细胞中PAWR的表达。4.circ_0068655正向心肌细胞中PAWR的表达第四部分Circ_0068655通过调节miR-498/PAWR信号通路抑制细胞活性促进细胞凋亡目的:利用体外实验观察缺氧介导的circ_0068655上调是否会通过sponge miR-498从而上调PAWR的表达促进心肌细胞凋亡。方法:1.将sh-circ_0068655及其对照组分别与miR-498抑制剂(miR-498-inhibitor)共转染HCMs,采用qRT-PCR和Western blot检测PAWR的表达水平。2.将sh-circ_0068655及其对照组分别与miR-498抑制剂(miR-498-inhibitor)共转染HCMs,采用MTT比色法观察心肌细胞活力,利用荧光分光光度计分析法监测Capspase-3活性,采用ELISA法检测细胞死亡,运用Trans-well技术检测缺氧处理后心肌细胞的迁移能力及侵袭能力。结果:1.qRT-PCR和Western blot结果显示,缺氧致使HCMs细胞PAWR表达明显增高,其蛋白水平表达明显增高(P<0.01);转染sh-circ_0068655和NC-inhibitor后可降低缺氧所致PAWR表达的增高,共转染sh-circ_0068655和miR-498抑制剂后与共转染sh-circ_0068655和NC-inhibitor组相比PAWR表达增高(P<0.01)。2.与对照组相比,HCMs共转染sh-circ_0068655及NC-inhibitor后,采用MTT比色法显示心肌细胞活力明显升高,荧光分光光度计分析法及ELISA法检测细胞死亡结果显示心肌细胞内Capspase-3活性明显降低及死亡细胞明显降低(P<0.01),Trans-well试验结果显示,细胞迁移及侵袭能力明显升高(P<0.01),共转染sh-circ_0068655及miR-498-inhibitor与共转染sh-circ_0068655及NC-inhibitor组相比,细胞活力明显降低,caspase活性明显升高,心肌细胞凋亡明显增加,细胞迁移及侵袭能力明显下降(P<0.01)。结论:1.circ_0068655通过吸附miR-498来调控PAWR的表达。2.miR-498抑制剂能逆转sh-circ_0068655对PAWR表达的调控。3.circ_0068655通过吸附miR-498上调PAWR从而促进细胞凋亡。