癌症作为一种严重危害人类生命健康的主要因素是目前直接导致人类死亡的重要疾病,近年来靶向治疗手段在癌症的治疗中发挥着重要作用。CLK2（CDC-Like-kinase2）蛋白激酶是一类双特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它的失调与很多癌症的发生、进展有关,是肿瘤靶向治疗的重要靶点。本课题以CLK2蛋白激酶为研究目标,建立了CLK2在原核细胞中的表达系统,搭建了CLK2蛋白激酶活性测试平台用来筛选44个嘌呤类化合物对CLK2蛋白激酶的抑制效果,筛选出CLK2激酶抑制效果最佳的化合物进行肿瘤细胞水平上的药理学活性评价。首先,构建了重组质粒PET-28a/CLK2以进行CLK2蛋白的诱导表达,实验结果得出,经1m M IPTG诱导、在20℃条件下诱导16 h可以得到高效表达的CLK2蛋白,最终纯化得到1.5 mg/m L的CLK2蛋白。其次,采用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay测试法对表达得到的CLK2蛋白进行激酶活性测试平台的搭建,最终以50μM的S6K-peptide作为底物、0.75mg/m L的CLK2蛋白浓度为测试条件进行44个嘌呤类化合物对CLK2蛋白激酶活性抑制效果的测试,实验结果表明:在44个嘌呤类化合物中VF13化合物对CLK2蛋白激酶的抑制效果最佳,其抑制率达到50%。最后,论文选择了内源性CLK2蛋白表达量较高的MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞,对CLK2蛋白抑制效果最好的VF13候选化合物的药理学活性开展了细胞水平评价。细胞划痕愈合实验及Transwell实验结果表明,化合物VF13可以有效抑制MDA-MB-231细胞的横向、纵向迁移;通过细胞克隆实验得出,化合物VF13可以抑制细胞的增殖;采用流式细胞仪检测了化合物VF13可以有效诱导细胞的凋亡、增加细胞内ROS水平的升高以及降低线粒体膜电位水平。此外VF13明显抑制了CLK2蛋白在MDA-MB-231细胞中的高表达,也有效抑制CLK2蛋白的下游蛋白SRSF1的表达。综上,本课题成功构建了CLK2蛋白激酶原核细胞的表达系统、搭建了体外CLK2蛋白激酶测试平台。并筛选出有效抑制CLK2蛋白激酶活性的小分子候选化合物以及验证了该化合物在三阴性乳腺癌细胞上发挥的药理学活性,这为以CLK2为靶点探索其抑制剂在恶性肿瘤的靶向治疗提供了新思路。