研究背景糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见且较严重的并发症之一,也是导致终末期肾衰竭最常见的原因。肾小管间质纤维化在DN进展中发挥重要作用,与肾功能损害密切相关,并且决定了肾脏预后。目前研究认为肾小管细胞衰老是DN肾间质纤维化中重要的细胞生物学事件。一方面,细胞衰老后通过分泌大量促炎、趋化因子等衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）,促进组织炎症与纤维化;另一方面,衰老细胞还具有凋亡抵抗表型,促使衰老细胞存活,并持续分泌释放SASP,导致其损害效应迁延和放大,加速组织炎症和器官纤维化。在DN中,研究已证明肾小管细胞衰老与肾间质纤维化及肾功能损害呈正相关。然而,肾小管细胞衰老的机制及其在DN肾间质纤维化中的作用目前尚不清楚。诱骗受体2（decoy receptor,Dc R2）是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的II型跨膜受体,目前被认为是肿瘤细胞标志,与肿瘤细胞凋亡抵抗、分化程度及预后不良有关。此外,Dc R2还被认为是衰老成纤维细胞的生物标志,与衰老细胞凋亡抵抗及肝脏纤维化密切相关。在DN肾组织中,我们前期研究发现Dc R2特异性表达于衰老肾小管细胞,与肾间质纤维化程度及肾功能损害密切关联;Dc R2阳性的衰老肾小管细胞高表达抗凋亡分子FLIP、低表达caspase-3而具有凋亡抵抗特性,可持续存活并释放SASP。然而,Dc R2与肾小管细胞衰老及其凋亡抵抗之间的关系,及其在DN肾间质纤维化中的作用尚不清楚。本研究将围绕衰老肾小管细胞的SASP和凋亡抵抗表型,从DN患者、STZ-DN小鼠模型、高糖诱导的原代肾小管细胞衰老模型三个维度,采用免疫共沉淀联合定量蛋白组学及生信分析探明Dc R2相互作用蛋白,进一步体内外调控Dc R2表达变化以探明Dc R2在肾小管细胞衰老表型及DN肾间质纤维化中的作用及机制。研究方法1.研究对象1.1纳入2012年1月至2019年12月在我院经活检确诊的DN患者,共计241例。排除合并有其他肾脏疾病、肿瘤、尿路感染和其他感染的患者,同时排除使用利尿剂、中药或肾毒性药物者或有严重肝或心功能不全的患者。根据尿微量白蛋白/肌酐比值（ACR）和肾功能分为早期DN（n=83）和晚期DN（n=158）。1.2构建STZ诱导的DN小鼠模型,并采用超声微泡技术经鼠尾静脉转染Dc R2-si RNA和Dc R2过表达质粒至肾脏,制备Dc R2低表达小鼠和Dc R2过表达小鼠模型,以实现体内调控Dc R2表达变化。1.3体外提取原代肾小管上皮细胞,构建高糖（30mmol/L）诱导的肾小管细胞衰老模型。体外慢病毒转染Dc R2si RNA、Dc R2过表达质粒,以实现体外调控Dc R2表达变化。2.具体方法和指标2.1免疫组化检测DN患者及STZ-DN肾组织中Dc R2表达水平,免疫荧光共染检测Dc R2与衰老标志（p16、p21、SA-β-gal）、SASP（IL-1β、IL-6、TGF-β1）、凋亡相关标志（FLIP、Bcl-2、caspase-3、caspase-8、Tunel）及纤维化指标（a-SMA、collagen I、collagen IV、fibronectin）之间的共定位关系。体外实验中,采用免疫磁珠分选出Dc R2阳性肾小管细胞,检测caspase-3活性,蛋白质印迹检测凋亡相关标志表达,流式细胞检测细胞凋亡率,ELISA检测细胞上清SASP水平。2.2体内调控Dc R2表达变化后,血尿指标（血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白/肌酐）评估肾功能,Masson检测肾间质纤维化面积,定量PCR、免疫组化、蛋白质印迹等多种方法评估纤维化标志、衰老、SASP、凋亡相关指标的表达变化。体外调控Dc R2表达变化后检测上述指标的表达变化。2.3在DN患者肾组织中免疫荧光共染检测Dc R2与TRAIL、DR5之间的共定位关系,免疫共沉淀分析STZ-DN肾组织中Dc R2与TRAIL、DR5之间的相互结合关系。2.4在DN患者肾组织及细胞样本中,采用免疫共沉淀联合定量蛋白组学筛选、生信分析Dc R2相互作用蛋白。从DN患者、STZ-DN小鼠模型及原代肾小管细胞三个维度,分别采用免疫共沉淀、免疫荧光共染等方法验证Dc R2与PRDX1、Dc R2与GRP78之间的相互作用。2.5在DN患者、STZ-DN肾组织中观察PRDX1表达量及分布;体外转染PRDX1si RNA及PRDX1过表达质粒,观察对细胞周期相关蛋白（CDK6、cyclin D1、p16）表达的影响。DN患者肾组织中检测GRP78表达量,以及GRP78与细胞衰老、凋亡相关指标的共定位关系;体外转染GRP78 si RNA及GRP78过表达质粒,观察对细胞凋亡相关指标表达的影响。2.6体外共转染Dc R2、PRDX1相关质粒,观察对肾小管细胞衰老及SASP的影响。体外共转染Dc R2、GRP78相关质粒,观察对肾小管细胞凋亡相关标志（caspase-3、7）表达的影响。2.7体内外调控Dc R2表达变化后,检测PRDX1 m RNA、蛋白及磷酸化水平的变化、PRDX1过氧化酶活性以及ROS水平;检测Akt及p-Akt表达水平。结果第一部分Dc R2-PRDX1介导肾小管细胞衰老及SASP,加速DN肾间质纤维化1.1 Dc R2促进DN肾间质纤维化1.1.1 Dc R2特异性表达于STZ-DN肾小管细胞,Dc R2表达水平随着DN进展逐渐升高,并与肾间质纤维化评分正相关。此外,Dc R2与纤维化指标共定位。1.1.2体内上调Dc R2表达后,STZ-DN小鼠肾间质纤维化面积增加,纤维化指标表达水平升高;下调Dc R2表达后有效抑制了肾间质纤维化,表明Dc R2可调控DN肾间质纤维化。1.2 Dc R2介导肾小管细胞衰老及SASP体内外过表达Dc R2后,肾小管细胞衰老标志、SASP指标表达水平增加;转染Dc R2-si RNA后呈现相反的结果,表明Dc R2可介导肾小管细胞衰老及SASP,进而加剧DN肾间质纤维化。1.3 Dc R2介导肾小管细胞衰老不依赖TRAIL/DR5信号通路DN患者肾组织中发现Dc R2不与TRAIL和DR5共定位;STZ-DN肾组织中发现Dc R2不与TRAIL和DR5结合;表明Dc R2介导肾小管细胞衰老表型是不依赖TRAIL/DR5信号。1.4筛选及验证Dc R2相互作用蛋白-PRDX1免疫共沉淀联合定量蛋白组学筛选、生信分析Dc R2相互作用蛋白,在DN患者肾组织、STZ-DN肾组织及细胞水平证实Dc R2可与PRDX1相互作用。1.5 PRDX1在肾小管细胞衰老及SASP中的作用PRDX1与细胞周期相关蛋白共定位。体外调控PRDX1表达可影响细胞周期相关蛋白表达,表明PRDX1可通过调控细胞周期介导肾小管细胞衰老。1.6 Dc R2-PRDX1介导衰老肾小管细胞及SASP的分子机制1.6.1 Dc R2抑制PRDX1过氧化物酶活性,促进肾小管细胞衰老及SASP体外过表达Dc R2后,PRDX1过氧化物酶活性降低、细胞ROS水平升高,促进肾小管细胞衰老;而低表达Dc R2后呈现相反的结果。1.6.2 Dc R2通过调控PRDX1磷酸化水平介导肾小管细胞衰老及SASP体外同时调控Dc R2和PRDX1后,可通过影响细胞周期相关蛋白表达,从而介导肾小管细胞衰老及SASP。上/下调Dc R2表达并不影响PRDX1的m RNA及蛋白水平,而影响PRDX1磷酸化水平,表明Dc R2是在翻译后水平影响PRDX1表达。第二部分Dc R2-GRP78介导衰老肾小管细胞凋亡抵抗表型,加速DN肾间质纤维化2.1 Dc R2介导DN衰老肾小管细胞凋亡抵抗表型体内外过表达Dc R2后,肾小管细胞衰老标志、抗凋亡相关指标表达升高,而促凋亡相关指标表达受抑;转染Dc R2-si RNA后呈现相反的结果,说明Dc R2可介导衰老肾小管细胞的凋亡抵抗表型。2.2筛选及验证Dc R2相互作用蛋白-GRP78免疫共沉淀联合定量蛋白组学筛选、生信分析Dc R2相互作用蛋白,在DN患者肾组织、STZ-DN及细胞水平证实Dc R2可与GRP78相互作用。2.3 GRP78在衰老肾小管细胞凋亡抵抗中的作用GRP78与衰老标志共定位,还高表达抗凋亡标志而低表达促凋亡标志。体外抑制GRP78表达后,促使凋亡标志表达水平升高、凋亡率增加,表明GRP78可调控衰老肾小管细胞凋亡抵抗。2.4 Dc R2-GRP78介导衰老肾小管细胞凋亡抵抗表型的分子机制2.4.1 Dc R2通过增强GRP78抗凋亡活性介导衰老肾小管细胞凋亡抵抗表型体外同时调控Dc R2和GRP78后,可影响caspase-7等凋亡相关标志表达。调控Dc R2表达变化后,可影响GRP78与caspase-7之间的结合、Akt的磷酸化水平。上述表明Dc R2通过p-Akt增强GRP78与caspase-7之间的结合,从而导致衰老肾小管细胞凋亡抵抗。全文结论1.本研究从DN患者、STZ-DN小鼠模型及细胞衰老模型三个维度,证明了Dc R2与PRDX1相互作用介导肾小管细胞衰老及SASP,从而加速DN肾间质纤维化。具体机制是Dc R2通过促进PRDX1磷酸化并调控细胞周期相关蛋白的表达,最终导致细胞周期停滞、细胞衰老和SASP产生。2.Dc R2与GRP78相互作用介导衰老肾小管细胞凋亡抵抗表型,从而促进DN肾间质纤维化。机制研究表明,Dc R2增强GRP78抗凋亡活性,破坏了抗凋亡和促凋亡蛋白表达的平衡,最终导致衰老细胞凋亡抵抗、存活积聚、SASP持续分泌和肾间质纤维化。