论文部分内容阅读
背景食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率呈增长趋势。食管癌细胞具有较强的增殖、迁移及侵袭等恶性行为,这也是食管癌发生发展的主要原因。食管癌的治疗手段主要有手术,放疗及化疗等。食管癌细胞易产生放疗抵抗,导致放疗效果不佳。因此,提高食管癌放射敏感性是当前研究的重要课题。环状RNA（circRNA）是一类呈闭合环状的非编码RNA,其可发挥微小RNA（miRNA）分子海绵调控靶基因的表达,进而对细胞增殖、凋亡、氧化应激等发挥调控作用。近年来研究显示,circRNA/miRNA/靶基因这一通路参与调控肿瘤细胞的恶性行为及放射敏感性,为肿瘤发病机制的阐明及治疗靶点的选择提供了新途径。circATIC在放射抵抗性的食管癌细胞中表达下调,但其对食管癌细胞恶性行为和放射敏感性的影响及机制还未阐明。Circbank靶基因在线软件预测显示,circATIC可能发挥miR-10b-3p分子海绵;Targetscan靶基因预测显示,RHCG 可能是 miR-10b-3p 的靶基因。但 circATIC 能否靶向 miR-10b-3p/RHCG轴调控食管癌细胞的恶性行为和放射敏感性也还未知。本研究主要从以下几部分探究circATIC对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭及放射敏感性的影响和分子机制:第一部分:检测circATIC在食管鳞癌组织和细胞系中的表达,分析食管鳞癌组织中circATIC表达与肿瘤分期及淋巴结转移的关系,同时分析circATIC在食管癌细胞中的表达定位,并对circATIC的稳定性进行检测;第二部分:构建过表达circATIC的食管癌细胞系,观察过表达circATIC对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭及放射敏感性的影响;第三部分:以miR-10b-3p/RHCG轴为切入点,观察过表达circATIC影响食管癌细胞增殖、迁移和侵袭及放射敏感性的分子机制;第四部分:通过裸鼠移植瘤实验探究过表达circATIC对体内肿瘤生长和放射敏感性的影响。第一部分circATIC在食管鳞癌组织和细胞中的表达及鉴定方法:1、收集2018年10月至2020年10月在南阳市中心医院行手术治疗的64例食管鳞癌患者的癌组织和癌旁正常组织,qRT-PCR法检测组织中circATIC表达,并分析食管鳞癌组织中circATIC表达与肿瘤分期及淋巴结转移的关系。2、体外培养食管上皮细胞HET-1A、食管癌EC109和KYSE150细胞,qRT-PCR法检测细胞中circATIC表达,核质分离实验分析circATIC在食管癌细胞中的表达定位,RNase R实验观察circATIC的稳定性。结果:1、食管鳞癌肿瘤组织中circATIC的表达量显著低于对应的癌旁正常组织（P＜0.05）。Ⅲ期食管鳞癌肿瘤组织中circATIC的表达量显著低于Ⅰ+Ⅱ期（P＜0.05）。淋巴结转移患者的肿瘤组织中circATIC的表达量显著低于淋巴结未转移患者（P＜0.05）。2、食管癌EC109和KYSE150细胞中circATIC的表达量明显低于食管上皮细胞HET-1（P＜0.05）。circATIC主要定位于食管癌EC109和KYSE150细胞的胞质中,且不易被RNase R降解。第二部分circATIC对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及放射敏感性的影响方法:1、分别转染circATIC过表达载体（oe-circATIC组）、空载体（vector组）至食管癌EC109和KYSE150细胞,qRT-PCR法检测细胞中circATIC表达验证转染效果,EdU实验观察细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移,Transwell小室实验检测细胞侵袭。2、将oe-circATIC组和vector组EC109和KYSE150细胞用不同剂量放射线照射后,克隆形成实验观察各组细胞存活分数。3、将转染 oe-circATIC、vector 的 EC109 和 KYSE150 细胞经 4 Gy 照射,记为 vector+4 Gy 组和 oe-circATIC+4 Gy 组,同时设置 vector组（转染 vector 的EC109和KYSE150细胞未经照射）,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting检测各组细胞中bcl-2、bax和c-caspase3蛋白表达。结果:1、oe-circATIC 组 EC109 和 KYSE150 细胞中 circATIC 表达显著高于 vector组（P＜0.05）。2、oe-circATIC组EC109和KYSE150细胞的EdU+数量、划痕愈合率、侵袭数量及细胞存活分数均低于vector组（P＜0.05）。3、与vector组比较,vector+4 Gy组EC109和KYSE150细胞凋亡率、细胞中bax和c-caspase3蛋白表达量均显著升高（P＜0.05）,bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;与 vector+4 Gy 组比较,oe-circATIC+4 Gy 组 EC109 和 KYSE150细胞凋亡率、细胞中bax和c-caspase3蛋白表达量均显著升高（P＜0.05）,bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。第三部分circATIC调控食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及放射敏感性的分子机制研究方法:1、双荧光素酶报告基因实验和RNA-pull down实验验证circATIC与miR-10b-3p、miR-10b-3p 与 RHCG 的靶向关系。qRT-PCR 法检测 vector 组和oe-circATIC 组 EC109 和 KYSE150 细胞中 miR-10b-3p 表达,Western blotting 检测miR-NC组和miR-10b-3p组EC109和KYSE150细胞中RHCG蛋白表达。2、qRT-PCR法检测食管鳞癌组织和细胞系（EC109和KYSE150）中miR-10b-3p 和 RHCG mRNA 表达,Western blotting 检测 RHCG 蛋白表达,并分析食管鳞癌组织中miR-10b-3p和RHCG mRNA表达与肿瘤分期及淋巴结转移的关系。3、将 EC109 和 KYSE150 细胞分为 EC109 和 KYSE150vector+miR-NC 组、oe-circATIC+miR-NC 组、oe-circATIC+miR-10b-3p 组、anti-NC+si-NC 组、anti-miR-10b-3p+si-NC 组、anti-miR-10b-3p+si-RHCG 组 EdU 实验观察细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移,Transwell小室实验检测细胞侵袭,克隆形成实验细胞存活分数。4、将 EC109 和 KYSE150 细胞分为 vector+miR-NC 组、vector+miR-NC+4 Gy组、oe-circATIC+miR-NC+4 Gy 组、oe-circATIC+miR-10b-3p+4 Gy 组、anti-NC+si-NC 组、anti-NC+si-NC 组+4 Gy 组、anti-NC+si-NC+4 Gy 组、anti-miR-10b-3p+si-NC+4 Gy组,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting检测各组细胞中bcl-2、bax和c-caspase3蛋白表达。结果:1、双荧光素酶报告基因实验和RNA-pull down实验结果显示,circATIC-WT可靶向结合 miR-10b-3p,miR-10b-3p 可靶向结合 RHCG。oe-circATIC 组 EC109和 KYSE150 细胞中 miR-10b-3p 表达低于 vector 组（P＜0.05）。miR-10b-3p 组EC109和KYSE150细胞中RHCG蛋白表达显著低于miR-NC组（P＜0.05）。2、与HET-1A细胞比较,食管癌EC109和KYSE150细胞中miR-10b-3p升高（P＜0.05）,RHCG蛋白表达降低（P＜0.05）。与癌旁正常组织比较,食管鳞癌肿瘤组织中miR-10b-3p表达升高（P＜0.05）,RHCG表达降低（P＜0.05）。与Ⅰ+Ⅱ期食管鳞癌肿瘤组织比较,Ⅲ期食管鳞癌肿瘤组织中miR-10b-3p表达升高（P＜0.05）,RHCG表达降低（P＜0.05）。与淋巴结未转移患者比较,淋巴结转移患者的肿瘤组织中miR-10b-3p表达升高（P＜0.05）,RHCG表达降低（P＜0.05）。3、与 anti-NC+si-NC 组比较,anti-miR-10b-3p+si-NC 组 EC109 和 KYSE150细胞的EdU+数量、划痕愈合率、侵袭数量及细胞存活分数均降低（P＜0.05）;与 anti-miR-10b-3p+si-NC 组比较,anti-miR-10b-3p+si-RHCG 组 EC109 和KYSE150细胞的EdU+数量、划痕愈合率、侵袭数量及细胞存活分数均升高（P＜0.05）。与 anti-NC+si-NC 组比较,anti-miR-10b-3p+si-NC 组 EC109 和KYSE150细胞的EdU+数量、划痕愈合率、侵袭数量及细胞存活分数均降低（P＜0.05）;与 anti-miR-10b-3p+si-NC 组比较,anti-miR-10b-3p+si-RHCG 组 EC109和KYSE150细胞的EdU+数量、划痕愈合率、侵袭数量及细胞存活分数均升高（P＜0.05）。4、与 vector+miR-NC 组比较,vector+miR-NC+4 Gy 组 EC109 和 KYSE150细胞凋亡率、细胞中bax和c-caspase3蛋白表达量均升高（P＜0.05）,bcl-2蛋白表达量降低（P＜0.05）;与 vector+miR-NC+4 Gy 组比较,oe-circATIC+miR-NC+4 Gy组EC109和KYSE150细胞凋亡率、细胞中bax和c-caspase3蛋白表达量均升高（P＜0.05）,bcl-2 蛋白表达量降低（P＜0.05）;与 oe-circATIC+miR-NC+4 Gy 组比较,oe-circATIC+miR-10b-3p+4 Gy 组 EC109 和 KYSE150 细胞凋亡率、细胞中bax和c-caspase3蛋白表达量均降低（P＜0.05）,而bcl-2蛋白表达量升高（P＜0.05）。与 anti-NC+si-NC 组比较,anti-NC+si-NC 组+4 Gy 组 EC109 和KYSE150细胞凋亡率、细胞中bax和c-caspase3蛋白表达量均升高（P＜0.05）,而bcl-2蛋白表达量降低（P＜0.05）;与anti-NC+si-NC+4 Gy组比较,anti-miR-10b-3p+si-NC+4 Gy 组 EC109 和 KYSE150 细胞凋亡率、细胞中 bax 和c-caspase3蛋白表达量均升高（P＜0.05）,而bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;与 anti-miR-10b-3p+si-NC+4 Gy 组比较,anti-miR-1 0b-3p+si-RHCG 组+4 Gy 组EC109和KYSE150细胞凋亡率、细胞中bax和c-caspase3蛋白表达量均降低（P＜0.05）,而bcl-2蛋白表达量升高（P＜0.05）。第四部分circATIC的裸鼠模型研究方法:BALB/c 裸鼠分为 vector组、circATIC 组、vector+4 Gy 组和 circATIC+4 Gy组。测量各组裸鼠移植瘤体积和重量,免疫组织化学法检测肿瘤组织中Ki67、RHCG和c-caspase3蛋白表达。结果:1、与vector组比较,circATIC组和vector+4 Gy组裸鼠移植瘤体积和重量均显著降低（P＜0.05）;与vector+4 Gy组比较,circATIC+4 Gy组裸鼠移植瘤体积和重量均显著降低（P＜0.05）。2、与vector组比较,circATIC组和vector+4 Gy组裸鼠移植瘤组织中Ki67蛋白表达显著减少（P＜0.05）,RHCG和c-caspase3蛋白表达显著增加（P＜0.05）;与vector+4 Gy组比较,circATIC+4 Gy组裸鼠移植瘤组织中Ki67蛋白表达显著减少（P＜0.05）,RHCG和c-caspase3蛋白表达显著增加（P＜0.05）。全文结论:1:circATIC在食管鳞癌肿瘤组织和食管癌细胞系中表达下调,且食管鳞癌肿瘤组织中的circATIC表达与肿瘤分期及淋巴结转移相关。2:过表达circATIC通过发挥miR-10b-3p分子海绵作用上调RHCG表达来抑制食管癌系细胞增殖、迁移和侵袭,同时增强放射敏感性。3:过表达circATIC抑制裸鼠移植瘤生长,并增强肿瘤组织的放射敏感性。circATIC有可能成为食管癌治疗的分子靶点。