论文部分内容阅读
目的:研究黄连素(berberine,BBR)对幽门螺杆菌(Helicobater pylori,H.pylori)多重耐药(multi-drug resistant,MDR)菌株对抗菌药物敏感性的影响,探讨黄连素在Acr AB-Tol C外排泵基因调控中的作用,为阐明黄连有效成分黄连素对H.pylori MDR菌株耐药性的影响及其作用机制提供实验依据。方法:第一部分:胃镜下采集胃粘膜标本,体外分离培养胃粘膜中的H.pylori,采用琼脂稀释法对H.pylori分离株进行阿莫西林、左氧氟沙星、克拉霉素、甲硝唑4种抗生素的药敏试验,并对其中的双重耐药菌株(double-drug resistant,DR)进行体外诱导耐药成为MDR菌株;采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)测定MDR菌株与敏感株中Acr AB-Tol C对应4种外排泵同源基因Hp0605-Hp0607、Hp0969-Hp0971、Hp1327-Hp1329、Hp1487-Hp1489的m RNA表达水平,并与MDR菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)进行相关性分析。第二部分:采用琼脂稀释法测定黄连素对MDR株的MIC值,以1/2 MIC的黄连素浓度液体培养MDR菌株,培养5代后采用E-test法测定对应耐药抗生素的MIC值变化,以黄连素作用后MIC值降低4倍及以上或变为敏感株为阳性标准;用RT-PCR测定黄连素作用前后外排泵基因的m RNA表达量差异,并与MDR菌株的MIC值变化进行相关性分析;分别提取黄连素作用前后MDR株的基因组DNA,对3种抗生素耐药靶基因进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)并测序,分析MDR菌株耐药基因突变与回复情况。结果:第一部分:(1)共成功分离出128株H.pylori菌株,根据药敏试验筛选出敏感株25株,单一耐药株61株,双重耐药株30株,临床分离MDR株12株,体外成功诱导出MDR株23株。H.pylori临床分离株对阿莫西林、左氧氟沙星、克拉霉素、甲硝唑的耐药率分别为4.7%、26.6%、32.0%、64.8%,多重耐药率为9.38%;(2)与敏感组相比,外排泵基因Hp0605、Hp0606、Hp1328的表达量在MDR组中明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),但与耐药抗生素的MIC值无明显相关性,其他外排泵基因的表达水平在两组之间无明显差异。第二部分:(1)黄连素对35株MDR株有明显的抑菌作用,且对不同MDR株的MIC值不同,其范围为:8-128μg/m L;(2)选取27株高水平耐药MDR株,经黄连素作用后分别有9株、11株、5株克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑的MIC值有阳性变化;(3)黄连素作用后外排泵基因Hp0605、Hp0606、Hp1328、Hp1488的表达量与作用前相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),但其与MDR株MIC值的变化无明显相关性;(4)3种抗生素的耐药基因的测序结果:(1)10株对克拉霉素耐药的MDR株均存在23S r RNA突变,突变形式多为T2186C、G2869A、A2147G;(2)8株对左氧氟沙星耐药的MDR株均存在gyr A突变,突变形式以C87A、C261G、G271A、A272G为主;(3)10株对甲硝唑耐药的MDR株均存在rdx A突变,突变点散在分布,但以突变形式A162G、G179A、C220T、G229A最为多见;(4)黄连素作用后成功逆转部分MDR株的耐药性,但并未发现特异性耐药基因的回复突变。结论:(1)外排泵基因Hp0605、Hp0606、Hp1328表达量的上调与耐药基因突变共同导致了H.pylori的多重耐药。(2)黄连素可能通过下调外排泵基因Hp0605、Hp0606、Hp1328、Hp1488的表达量而降低部分MDR株对3种抗生素的耐药性。