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【目的】
建立液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析小鼠大脑皮层、脑干组织全基因组甲基化、羟甲基化水平的方法，探讨基因组甲基化、羟甲基化水平变化在AD病理发展过程中的生物学作用。应用实时荧光定量PCR检测脑干中甲基转移酶DNMT1和羟化酶TET1表达水平的改变，寻找基因甲基化、羟甲基化及DNMT1酶、TET1酶表达在小鼠脑干组织中的特点和联系，为研究脑干区域基因甲基化、羟甲基化水平与阿尔茨海默病的关系打下基础。
【方法】
1.样品获取
从广东省医学实验动物中心购买阿尔茨海默病模型小鼠。采用摩里斯水迷宫（Morriswatermaze）法、酶联免疫吸附法(ELISA)验证所选模型小鼠是否符合AD标准。取小鼠大脑皮层、脑干等组织，置-80℃冰箱保存。
2.大脑皮层、脑干DNA提取
按照TIANGEN公司的基因组DNA提取试剂盒的操作步骤说明，提取AD小鼠及C57小鼠大脑皮层、脑干基因组DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带的完整性，并用紫外分光光度计进行浓度、纯度的检测，浓度和纯度合格的DNA用于下一步的分析。
3.LC-MS/MS分析
基因组甲基化、羟甲基化的LC-MS/MS分析：将提取得到的小鼠组织DNA加入Cyt13C15N2，在旋转蒸发仪中吹干后加入88%甲酸，于140℃环境温度下反应90mins水解。氮气吹干水解物后，用进样流动相复溶后离心，取上清液，置LC-MS/MS进行分析。
4.目的基因引物设计
TET1、DNMT1基因引物的设计：参照NCBI的Genbank已公布mRNA序列（GAPDH、DNMT1及TET1基因），利用DNAMAN软件设计用于realtime-PCR的引物，通过在线blast工具进行检测引物的特异性，筛选出合适的引物。
5.脑干组织RNA的提取
参照TIANGEN公司提取RNA试剂盒的操作说明，分别提取AD小鼠、C57小鼠脑干组织中的RNA，运用琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带的完整性，利用酶标仪对RNA的纯度、浓度进行测定。
6.脑干TET1、DNMT1表达水平的real-timePCR分析
荧光定量PCR条件为：95℃，变性，3mins；95℃，扩增延伸，5s；60℃，退火，31s；40个循环，在扩增阶段采集荧光信号，PCR结束后在55~95℃进行熔解曲线分析，最后分析TET1酶、DNMT1酶的表达水平。
【结果】
1.小鼠行为、认知评估结果
水迷宫实验结果：（1）在定位航行试验中，与C57对照组相比，AD小鼠的逃避潜伏期在第2、3、4天明显延长，结果具有统计学意义（P<0.05）。（2）从第5天起开始空间探索实验，结果显示，AD小鼠的跨平台行为频率低于相应的C57对照组，结果具有统计学意义（P<0.05）。此外，在站立时间和游泳距离这两个测试结果中，AD小鼠均明显短于相应的C57对照组，结果具有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明AD小鼠表现出阿尔茨海默病明显的行为和记忆障碍症状。
2.大脑Aβ42的表达水平
AD小鼠Aβ42蛋白表达明显高于对应的C57对照组，具有统计学意义(P<0.05)。因Aβ42蛋白沉积是AD的病理标志，再结合上述行为和认知评价结果，可以证实实验所选AD模型小鼠满足下一步的研究需求。
3.基因组甲基化分析结果
3.1大脑皮层、脑干基因组甲基化分析结果
结果显示，AD组小鼠大脑皮层、脑干基因组甲基化水平均明显高于对应月龄的C57对照组(P<0.05)。此外，AD小鼠及C57小鼠大脑皮层、脑干甲基化水平也随月龄的增加而呈上升趋势。
3.2大脑皮层、脑干基因组羟甲基化分析结果
结果显示，AD组小鼠大脑皮层、脑干基因组羟甲基化水平均明显高于对应月龄的C57对照组(P<0.05)。此外，AD小鼠及C57小鼠大脑皮层、脑干羟甲基化水平也随月龄的增加而呈上升趋势。
4.脑干TET1、DNMT1表达水平的实时荧光定量PCR分析
所有AD小鼠DNMT1、TET1表达水平均高于对应月龄的C57对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，C57对照组和AD组小鼠甲基转移酶DNMT1和羟化酶TET1相对表达水平从12个月到18个月呈下降趋势，表明这两种酶的活性随着年龄的增长而降低。
【结论】
1.本研究使用LC-MS/MS对AD小鼠和对应月龄的C57小鼠中的基因组5-mC和5-hmC进行了定量分析，该方法具有快速、灵敏、适用性强等优点。与相同月龄的对照组相比，AD小鼠基因组甲基化和羟甲基化水平显着增加，并且在AD的病程发展过程中，这两个胞嘧啶的修饰碱基有增加的趋势。这结果为AD病程发展过程基因组DNA甲基化、羟甲基化水平的持续增加提供了有力的证据。
2.本研究提供了阿尔茨海默病小鼠模型中脑干中动态DNA甲基化途径的表观遗传修饰的结果。该研究强化了AD发生与DNA甲基化、羟甲基化水平呈正相关的观点，并且AD发展会伴随着5-mC、5-hmC水平的持续增加以及DNMT1和TET1表达水平逐渐降低。双转基因小鼠模型脑干动态DNA甲基化模式的改变，可以从表观遗传学的角度加深我们对遗传AD发病机制的认识。
建立液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析小鼠大脑皮层、脑干组织全基因组甲基化、羟甲基化水平的方法，探讨基因组甲基化、羟甲基化水平变化在AD病理发展过程中的生物学作用。应用实时荧光定量PCR检测脑干中甲基转移酶DNMT1和羟化酶TET1表达水平的改变，寻找基因甲基化、羟甲基化及DNMT1酶、TET1酶表达在小鼠脑干组织中的特点和联系，为研究脑干区域基因甲基化、羟甲基化水平与阿尔茨海默病的关系打下基础。
【方法】
1.样品获取
从广东省医学实验动物中心购买阿尔茨海默病模型小鼠。采用摩里斯水迷宫（Morriswatermaze）法、酶联免疫吸附法(ELISA)验证所选模型小鼠是否符合AD标准。取小鼠大脑皮层、脑干等组织，置-80℃冰箱保存。
2.大脑皮层、脑干DNA提取
按照TIANGEN公司的基因组DNA提取试剂盒的操作步骤说明，提取AD小鼠及C57小鼠大脑皮层、脑干基因组DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带的完整性，并用紫外分光光度计进行浓度、纯度的检测，浓度和纯度合格的DNA用于下一步的分析。
3.LC-MS/MS分析
基因组甲基化、羟甲基化的LC-MS/MS分析：将提取得到的小鼠组织DNA加入Cyt13C15N2，在旋转蒸发仪中吹干后加入88%甲酸，于140℃环境温度下反应90mins水解。氮气吹干水解物后，用进样流动相复溶后离心，取上清液，置LC-MS/MS进行分析。
4.目的基因引物设计
TET1、DNMT1基因引物的设计：参照NCBI的Genbank已公布mRNA序列（GAPDH、DNMT1及TET1基因），利用DNAMAN软件设计用于realtime-PCR的引物，通过在线blast工具进行检测引物的特异性，筛选出合适的引物。
5.脑干组织RNA的提取
参照TIANGEN公司提取RNA试剂盒的操作说明，分别提取AD小鼠、C57小鼠脑干组织中的RNA，运用琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带的完整性，利用酶标仪对RNA的纯度、浓度进行测定。
6.脑干TET1、DNMT1表达水平的real-timePCR分析
荧光定量PCR条件为：95℃，变性，3mins；95℃，扩增延伸，5s；60℃，退火，31s；40个循环，在扩增阶段采集荧光信号，PCR结束后在55~95℃进行熔解曲线分析，最后分析TET1酶、DNMT1酶的表达水平。
【结果】
1.小鼠行为、认知评估结果
水迷宫实验结果：（1）在定位航行试验中，与C57对照组相比，AD小鼠的逃避潜伏期在第2、3、4天明显延长，结果具有统计学意义（P<0.05）。（2）从第5天起开始空间探索实验，结果显示，AD小鼠的跨平台行为频率低于相应的C57对照组，结果具有统计学意义（P<0.05）。此外，在站立时间和游泳距离这两个测试结果中，AD小鼠均明显短于相应的C57对照组，结果具有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明AD小鼠表现出阿尔茨海默病明显的行为和记忆障碍症状。
2.大脑Aβ42的表达水平
AD小鼠Aβ42蛋白表达明显高于对应的C57对照组，具有统计学意义(P<0.05)。因Aβ42蛋白沉积是AD的病理标志，再结合上述行为和认知评价结果，可以证实实验所选AD模型小鼠满足下一步的研究需求。
3.基因组甲基化分析结果
3.1大脑皮层、脑干基因组甲基化分析结果
结果显示，AD组小鼠大脑皮层、脑干基因组甲基化水平均明显高于对应月龄的C57对照组(P<0.05)。此外，AD小鼠及C57小鼠大脑皮层、脑干甲基化水平也随月龄的增加而呈上升趋势。
3.2大脑皮层、脑干基因组羟甲基化分析结果
结果显示，AD组小鼠大脑皮层、脑干基因组羟甲基化水平均明显高于对应月龄的C57对照组(P<0.05)。此外，AD小鼠及C57小鼠大脑皮层、脑干羟甲基化水平也随月龄的增加而呈上升趋势。
4.脑干TET1、DNMT1表达水平的实时荧光定量PCR分析
所有AD小鼠DNMT1、TET1表达水平均高于对应月龄的C57对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，C57对照组和AD组小鼠甲基转移酶DNMT1和羟化酶TET1相对表达水平从12个月到18个月呈下降趋势，表明这两种酶的活性随着年龄的增长而降低。
【结论】
1.本研究使用LC-MS/MS对AD小鼠和对应月龄的C57小鼠中的基因组5-mC和5-hmC进行了定量分析，该方法具有快速、灵敏、适用性强等优点。与相同月龄的对照组相比，AD小鼠基因组甲基化和羟甲基化水平显着增加，并且在AD的病程发展过程中，这两个胞嘧啶的修饰碱基有增加的趋势。这结果为AD病程发展过程基因组DNA甲基化、羟甲基化水平的持续增加提供了有力的证据。
2.本研究提供了阿尔茨海默病小鼠模型中脑干中动态DNA甲基化途径的表观遗传修饰的结果。该研究强化了AD发生与DNA甲基化、羟甲基化水平呈正相关的观点，并且AD发展会伴随着5-mC、5-hmC水平的持续增加以及DNMT1和TET1表达水平逐渐降低。双转基因小鼠模型脑干动态DNA甲基化模式的改变，可以从表观遗传学的角度加深我们对遗传AD发病机制的认识。