论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型（Porcine circovurus type2，PCV2）是猪腹泻综合征（PDS）、猪免疫缺陷综合征（PIDS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）等多种疾病的主要病原。猪圆环病毒病已经成为影响我国养猪业发展的主要疾病之一，对于该病的防治，主要是以疫苗免疫为主。我国在疫苗方面的研究，主要是以灭活疫苗为主，但灭活疫苗生产周期普遍较长，病毒滴度不高，主要刺激动物体液免疫等缺点或许是导致PCV2不能有效控制的原因所在。但在我国，猪圆环亚单位疫苗等新型疫苗却相对较少，并且无论灭活苗还是亚单位疫苗，大都是基于PCV2a和PCV2b亚型。虽然PCV2b亚型在我国仍然是主要流行毒株，但是2014年之后的流行病学调查显示，新兴的PCV2d亚型已经在广东山东等部分省份流行，并且已经成为这些省份的主要流行毒株，有学者推测，未来几年PCV2d亚型有取代PCV2b亚型并成为我国主要流行毒株的趋势，为有效控制该病，减少经济损失，所以研究基于PCV2d亚型的亚单位疫苗是一项紧迫而艰巨的任务。本研究在Sf9昆虫细胞中表达了PCV2d缺失核定位信号序列（ΔNLS）的Cap蛋白。 试验一 PCV2d亚型Cap蛋白基因（ΔNLS）克隆及序列分析 本试验根据GenBank中公布的PCV2 Cap蛋白基因序列的保守区，设计并合成引物,从临床PCV2疑似病料(淋巴结)中扩增去核定位信号序列的Cap蛋白基因，对PCR产物进行测序，利用分子生物学软件MegAlign对克隆基因序列的核苷酸、氨基酸同源性以及系统发育进化树进行分析，采用Protean软件对Cap蛋白克隆基因片段进行抗原表位的预测分析，最后对该克隆毒株进行毒力的预测分析。结果表明，该克隆基因序列与PCV2d亚型的氨基酸和核苷酸序列同源性最高分别100％和99.8%，而与其他亚型毒株的的氨基酸和核苷酸同源性分别为85.9%～94.2%和87.8%～94.1%；系统发育进化树显示该毒株与 PCV2d亚型属于同一个分枝，由此确定该克隆基因毒株属于 PCV2d亚型，命名为PCV2-SD；通过与商品化疫苗株的Cap蛋白抗原表位进行比对发现，该Cap蛋白克隆基因在约160aa-180aa位点处比商品化疫苗株多一处抗原表位；克隆基因毒株Cap蛋白关键氨基酸位点（N75aa/I76aa/T131aa）与 PCV2强致病性毒株一致，推测其属于强致病性毒株。 试验二PCV2d亚型Cap蛋白基因（ΔNLS）重组杆状病毒载体的构建 本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，将试验一扩增的去核定位信号序列的Cap蛋白基因插入到供体载体pFastBac1的BamHI/XhoI位点处，双酶切鉴定和PCR鉴定之后测序，并且对重组供体质粒的测序结果和试验一的 PCR产物测序结果进行比对。将测序正确的重组供体质粒转化到 DH10Bac感受态细胞中，对杆状病毒重组穿梭杆粒进行PCR鉴定。结果表明，该重组供体质粒的测序结果与试验一的PCR产物的测序结果一致，没有出现碱基的缺失或者突变，成功构建杆状病毒的重组供体质粒（pFastBac1-PCV2d-cap），通过PCV2特异性引物和M13引物PCR鉴定发现，成功构建杆状病毒重组穿梭杆粒（Bacmid-PCV2d-Cap），为后续转染Sf9昆虫细胞奠定了基础。 试验三PCV2d亚型Cap蛋白基因（ΔNLS）在Sf9昆虫细胞中的表达和鉴定 本试验利用无血清培养基培养 Sf9昆虫细胞，在细胞生长状态良好，经活细胞计数成活率在95%以上时，将试验二中构建正确的重组穿梭杆粒Bacmid-PCV2d-Cap转染到Sf9昆虫细胞。培养几天后，观察重组杆状病毒致细胞病变效应，对表达产物进行SDS-PAGE检测，并分别用猪圆环病毒2型阳性血清和鼠源的抗His单抗作为一抗进行Western-blot鉴定，用猪圆环病毒阳性血清和荧光素标记抗体羊抗猪IgG-FITC二抗进行间接免疫荧光试验鉴定。结果表明：Bacmid-PCV2d-Cap在 Sf9昆虫细胞中成功包装成杆状病毒并引起细胞病变，重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞SDS-PAGE后在大约24KD处出现与预期大小相符的蛋白条带，而对照组没有出现预期的蛋白条带；Western blot显示该蛋白可以与猪圆环病毒2型阳性血清和鼠源的抗His单抗反应并在大约24KD处出现了与预期大小相符的特异性免疫印记条带；间接免疫荧光试验发现，重组杆状病毒感染的S f9昆虫细胞中观察到绿色的免疫荧光反应，而对照组没有出现免疫荧光。综上说明，该Cap蛋白基因（ΔNLS）在Sf9昆虫细胞中成功表达。 本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，成功表达PCV2d亚型的去核定位信号序列的Cap蛋白，为后续PCV2d亚单位疫苗的研制以及ELISA试剂盒的研发奠定基础，以便为应对PCV2d亚型在我国的广泛流行提供物质和技术储备。