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猪圆环病毒2型(Porcine circovurus type2,PCV2)是猪腹泻综合征(PDS)、猪免疫缺陷综合征(PIDS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)等多种疾病的主要病原。猪圆环病毒病已经成为影响我国养猪业发展的主要疾病之一,对于该病的防治,主要是以疫苗免疫为主。我国在疫苗方面的研究,主要是以灭活疫苗为主,但灭活疫苗生产周期普遍较长,病毒滴度不高,主要刺激动物体液免疫等缺点或许是导致PCV2不能有效控制的原因所在。但在我国,猪圆环亚单位疫苗等新型疫苗却相对较少,并且无论灭活苗还是亚单位疫苗,大都是基于PCV2a和PCV2b亚型。虽然PCV2b亚型在我国仍然是主要流行毒株,但是2014年之后的流行病学调查显示,新兴的PCV2d亚型已经在广东山东等部分省份流行,并且已经成为这些省份的主要流行毒株,有学者推测,未来几年PCV2d亚型有取代PCV2b亚型并成为我国主要流行毒株的趋势,为有效控制该病,减少经济损失,所以研究基于PCV2d亚型的亚单位疫苗是一项紧迫而艰巨的任务。本研究在Sf9昆虫细胞中表达了PCV2d缺失核定位信号序列(ΔNLS)的Cap蛋白。 试验一 PCV2d亚型Cap蛋白基因(ΔNLS)克隆及序列分析 本试验根据GenBank中公布的PCV2 Cap蛋白基因序列的保守区,设计并合成引物,从临床PCV2疑似病料(淋巴结)中扩增去核定位信号序列的Cap蛋白基因,对PCR产物进行测序,利用分子生物学软件MegAlign对克隆基因序列的核苷酸、氨基酸同源性以及系统发育进化树进行分析,采用Protean软件对Cap蛋白克隆基因片段进行抗原表位的预测分析,最后对该克隆毒株进行毒力的预测分析。结果表明,该克隆基因序列与PCV2d亚型的氨基酸和核苷酸序列同源性最高分别100%和99.8%,而与其他亚型毒株的的氨基酸和核苷酸同源性分别为85.9%~94.2%和87.8%~94.1%;系统发育进化树显示该毒株与 PCV2d亚型属于同一个分枝,由此确定该克隆基因毒株属于 PCV2d亚型,命名为PCV2-SD;通过与商品化疫苗株的Cap蛋白抗原表位进行比对发现,该Cap蛋白克隆基因在约160aa-180aa位点处比商品化疫苗株多一处抗原表位;克隆基因毒株Cap蛋白关键氨基酸位点(N75aa/I76aa/T131aa)与 PCV2强致病性毒株一致,推测其属于强致病性毒株。 试验二PCV2d亚型Cap蛋白基因(ΔNLS)重组杆状病毒载体的构建 本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将试验一扩增的去核定位信号序列的Cap蛋白基因插入到供体载体pFastBac1的BamHI/XhoI位点处,双酶切鉴定和PCR鉴定之后测序,并且对重组供体质粒的测序结果和试验一的 PCR产物测序结果进行比对。将测序正确的重组供体质粒转化到 DH10Bac感受态细胞中,对杆状病毒重组穿梭杆粒进行PCR鉴定。结果表明,该重组供体质粒的测序结果与试验一的PCR产物的测序结果一致,没有出现碱基的缺失或者突变,成功构建杆状病毒的重组供体质粒(pFastBac1-PCV2d-cap),通过PCV2特异性引物和M13引物PCR鉴定发现,成功构建杆状病毒重组穿梭杆粒(Bacmid-PCV2d-Cap),为后续转染Sf9昆虫细胞奠定了基础。 试验三PCV2d亚型Cap蛋白基因(ΔNLS)在Sf9昆虫细胞中的表达和鉴定 本试验利用无血清培养基培养 Sf9昆虫细胞,在细胞生长状态良好,经活细胞计数成活率在95%以上时,将试验二中构建正确的重组穿梭杆粒Bacmid-PCV2d-Cap转染到Sf9昆虫细胞。培养几天后,观察重组杆状病毒致细胞病变效应,对表达产物进行SDS-PAGE检测,并分别用猪圆环病毒2型阳性血清和鼠源的抗His单抗作为一抗进行Western-blot鉴定,用猪圆环病毒阳性血清和荧光素标记抗体羊抗猪IgG-FITC二抗进行间接免疫荧光试验鉴定。结果表明:Bacmid-PCV2d-Cap在 Sf9昆虫细胞中成功包装成杆状病毒并引起细胞病变,重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞SDS-PAGE后在大约24KD处出现与预期大小相符的蛋白条带,而对照组没有出现预期的蛋白条带;Western blot显示该蛋白可以与猪圆环病毒2型阳性血清和鼠源的抗His单抗反应并在大约24KD处出现了与预期大小相符的特异性免疫印记条带;间接免疫荧光试验发现,重组杆状病毒感染的S f9昆虫细胞中观察到绿色的免疫荧光反应,而对照组没有出现免疫荧光。综上说明,该Cap蛋白基因(ΔNLS)在Sf9昆虫细胞中成功表达。 本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,成功表达PCV2d亚型的去核定位信号序列的Cap蛋白,为后续PCV2d亚单位疫苗的研制以及ELISA试剂盒的研发奠定基础,以便为应对PCV2d亚型在我国的广泛流行提供物质和技术储备。