【摘 要】
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奶牛乳房炎是乳腺组织由病原微生物感染所造成的炎症性疾病,其发病率高,治愈率低,易复发,会造成产奶量下降、乳品质降低,给现代奶业造成了极大的经济损失。近年来,国内外研究人员发现乳房炎的发生、发展过程及易感性和抗病性均受多个基因组成的基因网络的调控,其中NF-κB信号通路是重要的调节途径。但是,这些基因或信号通路对奶牛乳房炎的分子调控机制尚不完全清楚,因此阻碍了奶牛乳房炎抗性分子育种工作的有效开展。本
【基金项目】
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宁夏高等学校科学研究项目（优秀青年教师培育基金）（NGY2020007）； 国家自然科学基金地区项目（32060749）；
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奶牛乳房炎是乳腺组织由病原微生物感染所造成的炎症性疾病,其发病率高,治愈率低,易复发,会造成产奶量下降、乳品质降低,给现代奶业造成了极大的经济损失。近年来,国内外研究人员发现乳房炎的发生、发展过程及易感性和抗病性均受多个基因组成的基因网络的调控,其中NF-κB信号通路是重要的调节途径。但是,这些基因或信号通路对奶牛乳房炎的分子调控机制尚不完全清楚,因此阻碍了奶牛乳房炎抗性分子育种工作的有效开展。本实验利用LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）,成功构建了实验性细胞炎症模型,在此基础上,检测了 miR-223在LPS刺激下的表达量的变化;利用基因超表达/沉默、qPCR、ELISA、Western Blotting、CCK-8和流式细胞等技术,探究了 miR-223在LPS诱导的bMECs炎症模型中的功能,获得如下结果:（1）利用Targetscan和miRwalk软件分析了 miR-223的潜在靶基因,并使用Cluster Profiler软件包（R-3.2.4）分析了这些潜在靶基因所富集的信号通路。结果表明miR-223的潜在靶基因可能通过NF-κB炎症信号通路,参与调节细胞的增殖、分化及炎症反应。（2）成功构建了 7 个 mRNA（RHOB、PARP1、ACVR2A、ZNF395、ATP2B1、BRPF3 和NLRP3）-3’UTR的CHECK-2双荧光素酶报告基因载体,并通过双荧光素酶报告基因实验进行了靶基因鉴定,结果表明RHOB为奶牛miR-223的靶基因。（3）利用LPS诱导bMECs,采用qPCR技术检测了炎症相关基因的表达量,结果表明,炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA水平表达量均显著上调（P＜0.01）,表明LPS启动了bMECs的炎症反应,成功构建了 bMECs炎症模型。（4）在LPS诱导的bMECs炎症模型中,miR-223在炎症细胞模型中表达量显著上调（P＜0.01）,靶向抑制了 RHOB基因mRNA和蛋白质的表达（P＜0.01）;在炎症bMECs中超表达miR-223可在mRNA水平显著抑制炎症信号通路TLR4的表达水平（P＜0.01）,并在mRNA和蛋白水平显著抑制炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-8）及炎症信号通路NF-κB的表达水平（P＜0.05）,沉默miR-223则获得了相反的结果;此外,在炎症bMECs中超表达miR-223显著抑制了促凋亡相关基因BAX的表达（P＜0.01）,促进了抑制凋亡相关基因BCL2的表达（P＜0.05）,而沉默miR-223对BCL2的促进作用并未呈现相反的结果,因此利用流式细胞技术进一步验证,结果表明,超表达miR-223可以抑制bMECs的凋亡（P＜0.01）,并促进bMECs的增殖（P＜0.05）。（5）在LPS诱导的bMECs炎症模型中进行了 miR-223靶基因RHOB基因的干扰,并利用qPCR技术检测了炎症因子及炎症信号通路基因的表达,利用ELISA技术检测了炎症因子的分泌,并使用流式细胞仪检测了 bMECs的凋亡情况,结果发现,上述指标在干扰RHOB后的检测结果与超表达miR-223的结果完全一致,表明miR-223确实是通过抑制靶基因RHOB的表达来调节bMECs炎症反应及细胞凋亡。综上所述,miR-223是bMECs的抑炎基因,可通过靶向抑制RHOB和NF-κB的表达缓解bMECs的炎症反应;miR-223还可以促进bMECs的增殖,并通过靶向RHOB抑制了 bMECs的凋亡。研究从细胞水平上阐明了 miR-223在奶牛乳房炎中的功能,可为奶牛乳房炎的分子治疗和抗病分子育种提供新思路,具有潜在的应用价值。
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