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【目的】
探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)MALAT1在硝普钠(Sodium Nitroprusside，SNP)诱导人软骨细胞C28/I2损伤中的作用及机制。
【方法】
1.SNP体外诱导人软骨细胞C28/I2损伤模型的建立。
0.25mM、0.50mM、1.00mM、2.00mM、4.00mM浓度的SNP干预C28/I2细胞12h后，采用MTT比色法、AnnexinV-FITC双染法以及Hoechst33342染色法检测不同浓度SNP对细胞活力及凋亡的影响；WesternBlot法检测细胞中凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax及Bcl-2的表达；筛选SNP诱导C28/I2细胞损伤的最佳浓度。
2.长链非编码RNAMALAT1在SNP诱导的人软骨细胞C28/I2损伤中的作用。
采用qRT-PCR法分别检测SNP处理12h和SNP干预敲除MALAT1后的C28/I2细胞中MALAT1的表达水平；MTT比色法、AnnexinV-FITC以及Hoechst33342染色法检测细胞活力及凋亡情况；WesternBlot法检测细胞中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax及Bcl-2的表达。
3.长链非编码RNAMALAT1在SNP诱导的人软骨细胞C28/I2损伤中的作用机制
采用qRT-PCR法分别检测SNP处理12h和SNP干预敲除MALAT1后C28/I2细胞中miR-124表达水平；用mimic-miR-124转染C28/I2细胞后，qRT-PCR法检测经SNP处理后细胞中miR-124的表达水平的变化；MTT比色法、AnnexinV-FITC以及Hoechst33342染色法检测细胞活力及凋亡情况；WesternBlot法检测细胞中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax及Bcl-2的表达。
生物信息学预测miR-124下游靶基因；采用qRT-PCR法检测SNP处理C28/I2细胞12h后、SNP干预敲除MALAT1后及SNP干预过表达miR-124的C28/I2细胞中VIM表达水平的变化。
【结果】
1.MTT比色法、AnnexinV-FITC双染法以及Hoechst33342染色法结果显示经2.00mM、4.00mMSNP处理后的C28/I2细胞，其细胞活力降低(P＜0.05)、细胞凋亡率增加(P＜0.01)。SNP处理后细胞中Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达增加，Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax的比值降低(P＜0.01)。筛选出的SNP体外诱导C28/I2的最佳浓度为2.00mM。
2.经2.00mMSNP损伤12h后C28/I2细胞中MALAT1的表达增加(P＜0.01)。敲除MALAT1后能够下调MALAT1在SNP诱导的C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)，抵抗由SNP引起的细胞活力下降(P＜0.01)及细胞凋亡率升高(P＜0.01)，使Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达下调(P＜0.05)，而Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.01)。
3.经2.00mMSNP干预后，C28/I2细胞中miR-124的表达降低(P＜0.05)。过表达miR-124后能够上调miR-124在SNP损伤C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)，抵抗由SNP引起的细胞活力下降(P＜0.05)及细胞凋亡率升高(P＜0.01)，同时使Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达下调(P＜0.05)，而Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.01)。敲除MALAT1能够上调miR-124在SNP诱导的C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)，miR-124与MALAT1呈负相关。
4.经2.00mMSNP干预后，C28/I2细胞中VIM表达降低(P＜0.05)。敲除MALAT1和过表达miR-124能上调VIM在SNP诱导的C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)。
【结论】
1.SNP在体外能够诱导人软骨细胞C28/I2凋亡从而导致损伤的发生。
2.MALAT1促进由SNP诱导的人软骨细胞C28/I2细胞损伤。
3.MALAT1/miR-124/VIM可能是MALAT1促进SNP诱导人软骨细胞C28/I2损伤的关键信号通路。
探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)MALAT1在硝普钠(Sodium Nitroprusside，SNP)诱导人软骨细胞C28/I2损伤中的作用及机制。
【方法】
1.SNP体外诱导人软骨细胞C28/I2损伤模型的建立。
0.25mM、0.50mM、1.00mM、2.00mM、4.00mM浓度的SNP干预C28/I2细胞12h后，采用MTT比色法、AnnexinV-FITC双染法以及Hoechst33342染色法检测不同浓度SNP对细胞活力及凋亡的影响；WesternBlot法检测细胞中凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax及Bcl-2的表达；筛选SNP诱导C28/I2细胞损伤的最佳浓度。
2.长链非编码RNAMALAT1在SNP诱导的人软骨细胞C28/I2损伤中的作用。
采用qRT-PCR法分别检测SNP处理12h和SNP干预敲除MALAT1后的C28/I2细胞中MALAT1的表达水平；MTT比色法、AnnexinV-FITC以及Hoechst33342染色法检测细胞活力及凋亡情况；WesternBlot法检测细胞中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax及Bcl-2的表达。
3.长链非编码RNAMALAT1在SNP诱导的人软骨细胞C28/I2损伤中的作用机制
采用qRT-PCR法分别检测SNP处理12h和SNP干预敲除MALAT1后C28/I2细胞中miR-124表达水平；用mimic-miR-124转染C28/I2细胞后，qRT-PCR法检测经SNP处理后细胞中miR-124的表达水平的变化；MTT比色法、AnnexinV-FITC以及Hoechst33342染色法检测细胞活力及凋亡情况；WesternBlot法检测细胞中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax及Bcl-2的表达。
生物信息学预测miR-124下游靶基因；采用qRT-PCR法检测SNP处理C28/I2细胞12h后、SNP干预敲除MALAT1后及SNP干预过表达miR-124的C28/I2细胞中VIM表达水平的变化。
【结果】
1.MTT比色法、AnnexinV-FITC双染法以及Hoechst33342染色法结果显示经2.00mM、4.00mMSNP处理后的C28/I2细胞，其细胞活力降低(P＜0.05)、细胞凋亡率增加(P＜0.01)。SNP处理后细胞中Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达增加，Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax的比值降低(P＜0.01)。筛选出的SNP体外诱导C28/I2的最佳浓度为2.00mM。
2.经2.00mMSNP损伤12h后C28/I2细胞中MALAT1的表达增加(P＜0.01)。敲除MALAT1后能够下调MALAT1在SNP诱导的C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)，抵抗由SNP引起的细胞活力下降(P＜0.01)及细胞凋亡率升高(P＜0.01)，使Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达下调(P＜0.05)，而Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.01)。
3.经2.00mMSNP干预后，C28/I2细胞中miR-124的表达降低(P＜0.05)。过表达miR-124后能够上调miR-124在SNP损伤C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)，抵抗由SNP引起的细胞活力下降(P＜0.05)及细胞凋亡率升高(P＜0.01)，同时使Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9的表达下调(P＜0.05)，而Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.01)。敲除MALAT1能够上调miR-124在SNP诱导的C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)，miR-124与MALAT1呈负相关。
4.经2.00mMSNP干预后，C28/I2细胞中VIM表达降低(P＜0.05)。敲除MALAT1和过表达miR-124能上调VIM在SNP诱导的C28/I2细胞中的表达(P＜0.01)。
【结论】
1.SNP在体外能够诱导人软骨细胞C28/I2凋亡从而导致损伤的发生。
2.MALAT1促进由SNP诱导的人软骨细胞C28/I2细胞损伤。
3.MALAT1/miR-124/VIM可能是MALAT1促进SNP诱导人软骨细胞C28/I2损伤的关键信号通路。