研究背景乳糖是以单体分子形式存在于乳汁中的唯一双糖,由一分子半乳糖和葡萄糖缩合而成,在食品生产,制药中广泛应用,且与临床乳糖不耐症密切相关。人乳中乳糖含量最为丰富,除了为婴幼儿提供能量来源,乳汁中的乳糖还影响婴儿的大脑发育和肠道免疫,乳糖含量偏高超过婴儿能消化的上限会引起婴儿乳糖不耐症。母乳成分复杂且波动大,目前检测乳汁中乳糖的方法仍面临一些挑战,高效液相色谱法准确但操作繁琐,成本高;中红外光谱法操作简单但结果不准确;比色法由于操作简单,灵敏度高,成本低而被广泛应用,但母乳成分复杂需繁琐的前处理,且比色法结果稳定性差。因此,建立一种基于比色法且稳定性和准确性高的方法检测母乳中的乳糖具有重要的实际应用意义。目的将酶级联反应与比色法和反向传播（Back-propagation,BP）神经网络相结合,用BP神经网络拟合数据模型检测母乳中的乳糖。方法1建立乳糖检测方法,正交实验确定乳糖检测体系中各成分的比例。加入不同浓度的乳糖至反应体系,扫描溶液的吸收光谱,检测产物的吸收峰波长和吸光度,扫描乳糖浓度梯度实验的结果。2优化实验条件,配置p H=4,5,6,7的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,检测5m M乳糖在加入后不同时间点的吸光度。3检测在波长370nm和650nm处,浓度为0.25,0.5,0.75,1.0,1.25,1.5,1.75,2.0,2.25,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5m M的乳糖在反应后的第3,5,7,9,11min时的吸光度。4数据预处理,分析单一时间点单波长吸光度与乳糖浓度的关系,选择训练BP神经网络的输入值个数。5将确定的数据集分为训练集,测试集和验证集,取75组数据用于检测训练好的BP神经网络模型的预测性能。每个乳糖浓度输出5个预测值,取均值后与标准值对比。模型的均方误差图确定验证集的最佳均方误差的训练次数。误差直方图评估预测模型的预测效能。模型预测值与标准值对比,检验BP神经网络拟合模型的预测准确性。6预处理母乳,乳汁在37℃恒温融化,超声震荡10min,于4℃,10000rpm离心10min,分离中间液层乳汁用于检测。将2μL离心后的乳汁样本直接加入198μL缓冲液中进行光谱扫描,检测乳汁样本本身的浊度对比色分析的影响。7取2μL前处理后的乳汁样本至198μL的反应体系,检测反应体系在第3,5min时在370nm和650nm处的吸光度。结果输入BP神经网络模型预测乳糖浓度,与高效液相色谱法进行方法学比对。结果1光谱扫描和乳糖浓度梯度结果均显示,随乳糖含量增加,氧化底物增加,吸光度增加,乳糖浓度与吸光度成正相关。2在p H=6时,实验体系反应速度适中,乳糖加入后的前11min实验体系的吸光度仍在仪器检测限内,结合酸性条件下乳糖自分解增加的因素,最终选择实验体系的最适p H=6。3共750组吸光度数据,每组10个数据对应一个乳糖浓度,乳糖浓度梯度进行50次独立实验。4单波长单一时间点吸光度拟合数据模型,检测结果显示模型预测效果良好,考虑模型预测的准确性和更快的检测时间,选择乳糖加入后的前5min的吸光度进行BP神经网络模型训练。5 BP神经网络4个输入值的模型预测效果比单输入更好,R值达0.984,其误差直方图结果表示该模型预测性能良好,结果准确性高。6预处理后的乳汁样本光谱扫描结果与空白组几乎没有差异。表明乳汁样本本身的浊度不会影响比色分析。7比色法检测限为0.1m M,检测范围0.25-7.5m M。母乳样本检测结果输入BP神经网络模型,其预测的乳糖浓度与线性回归模型相比更接近HPLC结果,且平均变异系数更小。结论酶级联反应结合比色分析和BP神经网络可实现便捷准确检测母乳中的乳糖。