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油体是植物储存油脂的主要细胞器,是由半单位膜包裹三酰甘油（TAG）而形成的球体,半单位膜由单层磷脂分子及镶嵌在其中的油体结合蛋白构成。油体在植物光合系统建立之前通过乙醛酸循环体的脂肪酸β-氧化过程为植物种子萌发和幼苗发育提供碳水化合物及能量,在植物非生物胁迫应答方面也发挥着重要作用。油体结合蛋白包括油体蛋白、油体钙蛋白和油体固醇蛋白三种。三种蛋白中油体蛋白被广泛研究,油体钙蛋白及油体固醇蛋白研究较少。油体钙蛋白家族具有稳定油体结构、影响油脂合成及降解、参与钙离子调控的信号转导、膜融合及脂肪体融合以及非生物胁迫等多种功能。在拟南芥中,油体钙蛋白家族共有8个成员,分为H-Caleosin和L-Caleosin两类,H-Caleosin包括At CLO4-7,L-Caleosin包括At CLO1-3及At CLO8,目前研究比较少的为L-Caleosin。本研究以拟南芥油体钙蛋白为研究对象,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术及杂交手段,获得油体钙蛋白基因家族的多突变体,并对该家族的功能进行了初步探讨。主要工作分为两大部分:1油体钙蛋白基因家族多突变体的研究1.1油体钙蛋白基因家族多突变体的构建1.1.1双突变体的构建利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,同时对拟南芥同源序列极高的At CLO5和At CLO7基因进行编辑。通过设计两个sg RNA作用于两个基因的两个位置的方式敲除,鉴定出同时编辑掉两个基因的株系,得到了一株clo5/7-1纯合株系。根据同样原理,获得了clo4/6-1和clo4/6-2。所有突变体均已经去除Cas9背景。1.1.2四突变体的构建clo5/7-1分别与clo4/6-1和clo4/6-2进行杂交,F2代筛选得到clo4/5/6/7-1和clo4/5/6/7-2突变体。1.1.3六突变体的构建本实验在clo4/5/6/7-1的基础上,同时敲除At CLO1和At CLO2,原理同上,得到了两株纯合六突变体株系clo1/2/4/5/6/7-1和clo1/2/4/5/6/7-2。由于At CLO3与At CLO8同源序列相似度不高,通过设计两个sg RNA分别作用于两个基因,在clo4/5/6/7-1基础上敲除At CLO3和At CLO8基因,得到了一株纯和株系clo3/4/5/6/7/8-1,以上突变体均已去除Cas9背景。1.1.4八突变体的构建clo1/2/4/5/6/7-1和clo3/4/5/6/7/8-1进行杂交,通过筛选F2代获得一株纯合并去除Cas9的八突变体clo1/2/3/4/5/6/7/8-1。1.2油体钙蛋白家族的功能研究1.2.1 L-Caleosin的表型观察连续观察L-Caleosin突变体和Col-0的整个发育过程中的生长表型,突变体与野生型对照植株在生长发育期间无明显差异。1.2.2 L-Caleosin突变体的萌发胁迫实验本实验以Col-0、clo5/7-1、clo4/6-1和clo4/5/6/7-1为材料,探究胁迫条件下突变体与野生型的萌发情况。ABA处理结果显示1μM ABA条件下,相比Col-0,突变体对ABA敏感性增加;不同浓度的甘露醇、Na Cl及不同程度的低温胁迫条件下,突变体与Col-0无明显差异。1.2.3 L-Caleosin突变体根对胁迫响应我们将在1/2 MS正常萌发四天的Col-0、clo5/7-1、clo4/6-1和clo4/5/6/7-1幼苗分别移到1/2 MS,1/2 MS+150 m M甘露醇、1/2 MS+100 m M Na Cl和1/2MS+50μM ABA的培养基上,统计六天后的生根长短。在150 m M甘露醇处理下,与Col-0相比,clo4/5/6/7-1根的伸长较短,对甘露醇比较敏感;在100 m M Na Cl处理下,clo4/6-1与Col-0相比根的伸长量增加;在150μM ABA处理下,与Col-0相比,clo5/7-1、clo4/6-1和clo4/5/6/7-1对ABA敏感。1.2.4 L-Caleosin突变体离体叶片失水试验Col-0、clo5/7-1、clo4/6-1和clo4/5/6/7-1在1/2 MS培养基上生长22天后,对四种材料进行离体叶片失水试验,实验结果表明,与Col-0相比,clo4/6-1对干旱有一定的耐受性,失水量略少。1.2.5 L-Caleosin突变体蔗糖依赖实验在1/2 MS无蔗糖培养基上点种Col-0、clo5/7-1、clo4/6-1和clo4/5/6/7-1,培养8天。结果表明,突变体与Col-0相比根的伸长量无明显差异。1.2.6 L-Caleosin突变体在有无蔗糖黑暗处理下下胚轴伸长度统计在1/2 MS无蔗糖培养基上点种Col-0、clo5/7-1、clo4/6-1和clo4/5/6/7-1并在黑暗条件下培养8天。结果表明,突变体与Col-0相比下胚轴的伸长量无差异。1.2.7 L-Caleosin突变体尼罗红染色油脂观察本实验将剖除种皮的野生型和突变体种子用1μg/ml尼罗红染色,在激光共聚焦显微镜观察萌发种子0 h、24 h、48 h、72 h的脂质动员情况,实验结果显示clo5/7-1、clo4/6-1、clo4/5/6/7-1与Col-0相比,没有明显差异。1.2.8 Caleosin突变体对蔗糖依赖实验在1/2 MS无蔗糖培养基上点种Col-0、clo4/5/6/7-1和clo1/2/4/5/6/7-1,并培养5天。结果表明,与Col-0相比,clo1/2/4/5/6/7-1发育迟缓。1.2.9 Caleosin突变体脂肪酸定量分析脂肪酸定量检测结果表明,与Col-0相比,clo5/7-1、clo4/6-1、clo4/5/6/7-1和clo1/2/4/5/6/7-1脂肪酸总量低。另外,clo1/2/4/5/6/7-1中C18:1所占总脂肪酸比例较高;而C20:1所占总脂肪酸比例较低。2.脱靶突变体95号的研究2.1 95号突变体的表型分析95号突变体是在筛选clo4/6过程中得到的突变植株,突变体生长发育缓慢,生命周期增加;叶面积很小;抽薹比较晚;花的形状不规则,雄蕊个数不足,花丝偏短,造成花器官授粉不足,结实量降低。2.2 95号突变体的基因定位我们将95号突变体与不同生态型的Col-0和Ler野生型分别进行杂交,获得F2代的分离株系。该突变体与Col-0杂交的F2代表型符合3:1的分离比,通过分析我们还发现该脱靶位点跟At CLO4/6存在连锁关系,定位工作正在进行中。本论文的创新点拟南芥基因组中,油体钙蛋白基因家族共有8个成员,其中,At CLO4和At CLO6,At CLO5和At CLO7基因紧密连锁并且基因序列也具有高度同源性,利用传统的T-DNA插入、杂交等手段很难得到同时敲除多基因的突变体,CRISPR-Cas9基因编辑技术可以一次性编辑多个基因,本研究将CRISPR-Cas9基因编辑技术及传统杂交方法相结合获得油体钙蛋白家族成员的多突变体,对深入研究油体钙蛋白基因家族在植物生长及发育中的功能奠定基础。