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过氧化物酶体是真核细胞中由一层单位膜包被的细胞器,主要在脂肪酸β-氧化、支链氨基酸的降解以及ROS解毒中起重要作用。过氧化物酶体蛋白主要包括膜蛋白和基质蛋白两种,基质蛋白通常带有靶向序列信号PTS1或PTS2。拟南芥过氧化物酶体中除参与各种代谢反应的酶之外还有多种参与蛋白质降解的蛋白酶。有研究报道过氧化物酶体中可能存在9种蛋白酶,分别由AT5G47040（LON2）、AT1G28320（DEG15）、AT2G41790（PXM16）、AT2G18080、AT2G35615、AT3G57810、AT4G14570（AARE）、AT4G36195和AT4G20310基因编码。除LON2、DEG15、PXM16、AT2G18080和AT2G35615之外,其它蛋白酶的功能及作用机制目前所知甚少。本课题选择上述蛋白酶编码基因中的AT3G57810、AT4G14570、AT4G36195和AT4G20310为研究对象,旨在探讨几种蛋白酶在过氧化物酶体的蛋白质量控制过程中可能的作用。主要工作包括以下几个方面:1.蛋白酶的亚细胞定位研究构建了四种蛋白酶的全长或部分序列的荧光蛋白融合表达载体,通过转化洋葱表皮细胞对其亚细胞定位进行分析。结果表明,AT3G57810定位于过氧化物酶体、线粒体及叶绿体,AT4G14570（752-820 aa）定位于过氧化物酶体,AT4G36195定位于内质网,AT4G20310及AT4G14570（468-820 aa）均定位于细胞核和细胞质。本课题的主要目的是对过氧化物酶体中蛋白酶的功能进行研究,所以重点针对定位于过氧化物酶体的AT3G57810基因进行进一步实验。2.AT3G57810的组织表达及功能研究2.1 AT3G57810的组织特异性表达构建了ProAT3G57810∷GUS的表达载体,转化拟南芥并检测其组织性特异性表达情况,结果表明在检测的各种组织中,AT3G57810在茎生叶、花和角果中表达较多,在莲座叶中表达较少。2.2 at3g57810突变体的构建及AT3G57810功能分析为了研究AT3G57810基因的功能,利用CRISPR-Cas9技术获得了AT3G57810基因的2个纯合但编辑位点不同的突变体at3g57810-1和at3g57810-2。at3g57810-1在起始密码子后28 bp处缺失2个碱基,at3g57810-2在起始密码子后23 bp处缺失7个碱基。分别对两个突变体在各种处理条件下的表型进行了观察分析。2.2.1正常培养条件下,at3g57810突变体的表型观察正常培养条件下,在植株的整个生长发育阶段,突变体at3g57810-1和at3g57810-2的生长表型与野生型相比没有明显差异。2.2.2热应答和盐胁迫下,at3g57810突变体的表型观察。Arabidopsis e BF Browser分析结果显示:受热处理之后3小时内,AT3G57810基因的表达量受热诱导而明显升高。在本实验中,对在MS培养基上萌发并生长8 d的突变体幼苗进行热激处理,3 d后观察表型,结果显示at3g57810突变体生长良好,而且与野生型相比表型无明显差异。at3g57810突变体的种子在MS培养基上萌发6 d的幼苗分别移至含有0、100、150及200 m M Na Cl的MS培养基上生长5 d观察表型,结果显示:at3g57810突变体生长良好,与野生型相比无明显差异。2.2.3 at3g57810突变体对IBA胁迫应答及对蔗糖的依赖情况为了观察AT3G57810是否参与脂肪酸的β-氧化过程,对at3g57810突变体进行了IBA的胁迫应答及蔗糖的依赖实验。LON2为过氧化物酶体中的蛋白酶,参与过氧化物酶体的自噬等过程。本实验以突变体lon2作为对照。适当的IBA浓度能够诱导拟南芥幼苗产生侧根,lon2突变体中LON2的缺失可造成过氧化物酶体IBA代谢缺陷,使得lon2对IBA的反应不敏感。在10μM IBA处理条件下,lon2突变体没有侧根产生,突变体at3g57810-1和at3g57810-2与野生型都有侧根产生,两者相比生长情况无明显差异。lon2突变体中LON2的缺失可抑制过氧化物酶体脂肪酸的β-氧化作用,从而抑制植株生长。at3g57810突变体的种子分别在MS+1%蔗糖、MS–蔗糖的培养基上萌发并生长8 d,观察突变体对于蔗糖的依赖情况。结果表明,在有蔗糖的条件下,lon2的植株与野生型相比较小,at3g57810-1和at3g57810-2与野生型生长良好,没有明显表型差别。在无蔗糖的条件下,lon2的生长受到明显抑制,at3g57810-1和at3g57810-2与野生型生长良好,而且没有明显表型差别。结果表明AT3G57810可能不参与脂肪酸β-氧化。2.2.4 at3g57810突变体的蛋白表达水平检测分析LON2作为本实验的对照。LON2参与过氧化物酶体蛋白的降解,研究表明LON2影响PMDH（过氧化物酶苹果酸脱氢酶）由前体到成熟蛋白的转化过程,但对于乙醛酸循环关键酶ICL（异柠檬酸裂解酶）与MLS（苹果酸合成酶）的降解没有明显影响。AT3G57810与LON2同为过氧化物酶体蛋白酶,为了探讨两者之间是否存在某种联系,分别以生长4、6、8 d的幼苗为实验材料,在蛋白水平上检测了lon2及at3g57810突变体中ICL、MLS和PMDH蛋白表达量的变化。结果表明lon2、at3g57810突变体及野生型幼苗中ICL、MLS的降解趋势没有明显区别,lon2中PMDH前体明显积累,但at3g57810突变体及野生型幼苗中没有PMDH前体的积累。结果说明AT3G57810并没有影响ICL和MLS的正常降解,也没有影响PMDH前体的成熟过程。3.通过转录组学分析筛选参与过氧化物酶体蛋白降解的蛋白酶实验结果中显示AT3G57810并不参与ICL和MLS的降解,因此我们又继续筛选了可能参与ICL和MLS降解的蛋白酶。取4、6、8 d Col-0的幼苗做RNA-Seq测序,对表达差异的基因进行分析,结果筛选4 d到8 d的幼苗样品中中表达量上升的编码蛋白酶的基因共45个,对这些基因编码的蛋白酶是否带有PTS信号进行了筛选,结果筛选到5种蛋白酶,AT3G57460、AT3G57470、AT2G03200、AT4G12910、AT4G36195。其中AT4G36195在本实验前期做过基因枪亚细胞定位,定位于内质网上,而AT2G03200和AT4G12910定位于细胞质和细胞核中,可能不直接参与过氧化物酶体相关蛋白的降解。对于AT3G57460、AT3G57470蛋白酶基因是否能够参与ICL和MLS的降解,还有待进一步研究。4.NBR1不能阻断lon2突变体诱导的过氧化物酶体自噬研究发现LON2蛋白酶能够参与过氧化物酶体自噬过程,LON2的缺失使自噬增强,而关键的自噬基因ATG2,ATG3和ATG7的缺失可以阻断lon2诱导的自噬,而该过程中的拟南芥过氧化物酶体自噬受体未得到鉴定。在动物中,NBR1是过氧化物酶体自噬受体,做为植物中的同源蛋白,拟南芥NBR1是否是过氧化物酶体自噬受体,目前没有研究。所以本实验在lon2突变体的基础上敲除NBR1,在蛋白水平上检测lon2 nbr1双突变体中的ICL、MLS、PMDH、Thiolase表达量的变化。结果显示lon2 nbr1双突变体幼苗中ICL、MLS、Thiolase的降解趋势与lon2中的降解趋势没有明显区别,lon2及lon2 nbr1突变体中PMDH前体明显积累,但野生型幼苗中没有PMDH前体的积累。结果说明NBR1功能的缺失,并不能阻断lon2诱导的过氧化物酶体自噬。