【摘 要】
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花青素是高等植物中普遍存在的水溶性黄酮类色素,赋予水果、蔬菜、花卉和种子以红色、蓝色和紫色,同时具有抗氧化活性,因而在预防心血管疾病、癌症和糖尿病等方面担任重要作用。花青素生物合成的调控因子主要包括MYB、碱性螺旋-环-螺旋（b HLH）和WD40蛋白,它们相互作用形成MYB-b HLH-WD40（MBW）复合物,其中MYB是调控植物花青素合成最关键的转录因子。R2R3-MYB是MYB家族中的第一
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花青素是高等植物中普遍存在的水溶性黄酮类色素,赋予水果、蔬菜、花卉和种子以红色、蓝色和紫色,同时具有抗氧化活性,因而在预防心血管疾病、癌症和糖尿病等方面担任重要作用。花青素生物合成的调控因子主要包括MYB、碱性螺旋-环-螺旋（b HLH）和WD40蛋白,它们相互作用形成MYB-b HLH-WD40（MBW）复合物,其中MYB是调控植物花青素合成最关键的转录因子。R2R3-MYB是MYB家族中的第一大亚族,诸多研究表明R2R3-MYB蛋白参与花青素的调控等植物代谢过程。本研究从耐盐模式植物盐芥中克隆了一个R2R3-MYB家族成员EsMyb90基因,将35S:EsMyb90过量表达载体分别导入烟草和拟南芥,对EsMyb90异源表达的转基因植株进行表型观察,并对转基因植株不同组织的花青素含量和花青素合成结构基因的表达进行分析,结果表明,EsMyb90异源表达促进转基因烟草和拟南芥茎、叶和花等组织器官中花青素的合成。另外,EsMyb90转基因烟草抗氧化胁迫相关生理指标如SOD、CAT和APX活性测定表明,EsMyb90基因显著提高了转基因植株的抗氧化活性。实验结果具体如下:1.EsMyb90的序列分析盐芥EsMYB90包含R2和R3 DNA结合结构域,属于R2R3-MYB家族成员。系统发育进化分析表明,EsMYB90与拟南芥At MYB75、At MYB90和At MYB114处于同一进化分支,具有最近的进化关系;同时,与MYB蛋白金鱼草Am ROSEA1（44%）、苹果Md MYB10（42%）、葡萄Vv MYBA1（40%）和葡萄风信子Ma AN2（39%）等也具有一定的同源性。这些R2R3-MYB在植物花青素合成和调控中的作用均有报道。鉴于来自耐盐模式植物盐芥EsMYB90与其他植物MYB蛋白同源性均低于80%,因而盐芥EsMYB90可能在花青素调控中具有不同于其他植物R2R3-MYB的调控机制。2.35S:EsMyb90过量表达载体的构建及转基因植株的获得构建pCAMBIA3301H-35S:EsMyb90过量表达载体,农杆菌介导法转化烟草和拟南芥,Bastar筛选和PCR分子鉴定,对初步筛选的转基因植株进行加代纯合,得到纯合的转基因植株。3.EsMyb90定位于细胞核构建pCAT-35S:EYFP-EsMyb90融合表达载体,质粒轰击将重组质粒导入洋葱表皮细胞,荧光显微镜观察结果表明EsMyb90定位于细胞核。4.EsMyb90转基因植株表型观察EsMyb90转基因烟草和拟南芥植株中均有显著的花青素积累。其中,转基因烟草花青素积累主要表现在茎、叶、花和果荚;转基因拟南芥花青素积累则不仅表现在茎、叶、花和果荚,根和种子中也能观察到明显的花青素积累。由此说明,EsMyb90在烟草和拟南芥中的异源表达具有组织特异性。5.EsMyb90显著提高了转基因植株的花青素含量花青素含量检测发现,较之于野生型,EsMyb90转基因烟草和拟南芥花青素含量显著提高,其中转基因烟草EsMyb90-4株系茎、幼叶、成熟叶、花、果荚和种子中的花青素含量分别是野生型的48.79、95.17、45.67、4.94、17.75和2.58倍;转基因拟南芥EsMyb90-3株系根、茎、叶、花、果荚和种子中花青素的含量分别是野生型的46.88、64.32、24.21、41.48、81.88和36.55倍。由此说明,EsMyb90在烟草和拟南芥中的异源表达,显著提高了转基因植株的花青素水平。6.EsMyb90上调转基因植株中花青素合成基因的表达水平实时定量PCR分析发现,较之于野生型,EsMyb90转基因烟草花青素合成结构基因Nt PAL、Nt CHS、Nt CHI、Nt DFR、Nt LDOX和Nt UFGT在茎、叶和花组织中均表达上调,尤其是晚期花青素生物合成基因Nt DFR、Nt LDOX和Nt UFGT上调更为显著,其中在转基因烟草EsMyb90-4株系中,Nt LDOX在茎、叶和花中的表达量分别是野生型的3795.39、14489.79和4.93倍。7.EsMyb90提高转基因烟草的抗氧化活性烟草抗氧化酶活性测定发现,在正常生长条件和150 m M Na Cl胁迫条件下,EsMyb90转基因烟草的SOD、CAT和APX等抗氧化酶活性均明显高于野生型。由此可见,EsMyb90显著提高了转基因烟草的抗氧化能力。总之,EsMyb90在烟草和拟南芥中的异源表达显著增强了转基因植株的色素积累,提高了转基因植株的花青素含量和花青素合成结构基因的表达;同时,也增强了转基因植株的抗氧化能力。由此说明,盐芥EsMyb90在调控花青素合成中担任重要作用,但关于EsMyb90的调控机制尚需进一步深入研究。
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