【摘 要】
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目的:探讨实体瘤微环境中是否存在抑制CD8+T细胞增殖和功能的TDSFs;筛选并验证肿瘤微环境中的关键TDSFs;分析CST2在肿瘤患者预后中的作用方法:（1）通过Easy Sep Mouse Pan-Naive T Cell Isolation Kit磁珠分选获取小鼠脾脏中的Na（?）ve T细胞,以及CD3/28体外刺激Naive T细胞的增殖与活化。（2）通过流式细胞术和CFSE活细胞荧光标
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目的:探讨实体瘤微环境中是否存在抑制CD8+T细胞增殖和功能的TDSFs;筛选并验证肿瘤微环境中的关键TDSFs;分析CST2在肿瘤患者预后中的作用方法:（1）通过Easy Sep Mouse Pan-Naive T Cell Isolation Kit磁珠分选获取小鼠脾脏中的Na（?）ve T细胞,以及CD3/28体外刺激Naive T细胞的增殖与活化。（2）通过流式细胞术和CFSE活细胞荧光标记,对比在完全培养基（complete medium,CM）和多个癌种肿瘤条件培养基（tumor conditioned medium,TCM）培养下,CD8+T细胞的增殖（标记荧光的稀释信号）以及功能分子（Granzyme B和IFN-γ）的差异。（3）研究基于生物信息学分析大数据,TCGA数据库提取乳腺癌,结肠癌和皮肤癌原始m RNA的表达处理数据,下载分泌蛋白数据集,差异分析获取肿瘤中高表达的分泌蛋白基因。（4）通过q-PCR验证差异基因在乳腺癌,结肠癌和黑色素瘤细胞水平的表达。（5）通过K-M生存分析和Western-Blot在肿瘤患者中探讨能做为预后标记物的关键基因。结果:（1）与CM培养组相比,TCM培养组的CD8+T细胞未观察到明显的CFSE荧光稀释信号,且MFI显著升高（p＜0.05）,提示肿瘤细胞培养上清中存在明显抑制T细胞增殖的分泌因子（2）与CM培养组相比,TCM培养组CD8+T的Granzyme B和IFN-γ表达量显著降低（p＜0.05）,表明肿瘤细胞培养上清中存在显著抑制CD8+T细胞功能的分泌因子。（3）通过差异分析,在乳腺癌,结肠癌和皮肤癌中筛选获得13个显著高表达的分泌蛋白基因,分别是SPP1、ESM1、LRP8、NXPH1、MMP10、MMP1、ADAMTS20、CCL25、GDF15、CST2、BPIFB1、R3HDML、MMP11。（4）通过q-PCR与正常乳腺上皮细胞相比,在MDA231,MCF-7,ZR7530,T47D,BT549乳腺癌细胞系中,上述基因均显著高表达。（5）通过K-M生存分析和Western-Blot,CST2能做为预测肿瘤患者预后生存的生物标记物。结论:实体瘤中存在显著抑制CD8+T细胞增殖和功能的TDSFs,在TME中肿瘤细胞能通过产生TDSFs抑制CD8+T细胞的增殖和活化。通过生信挖掘和q-PCR验证,在癌症患者中中,存在SPP1、ESM1、LRP8、NXPH1、MMP10、MMP1、ADAMTS20、CCL25、GDF15、CST2、BPIFB1、R3HDML、MMP11等13个显著高表达的分泌蛋白基因。CST2能做为预测肿瘤患者预后生存的生物标记物。
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